山楂中黃酮類化合物的測定方法概述 (5)(五)

  當(dāng)向黃酮類化合物的甲醇（或乙醇）溶液中分別加入甲醇鈉（NaOMe）、乙酸鈉（NaOAc）、乙酸鈉-硼酸（NaOAc-H3BO3）、三氯化鋁或三氯化鋁-鹽酸（AlCl3/HCl）試劑能使黃酮的酚羥基離解或形成絡(luò)合物等，導(dǎo)致光譜發(fā)生變化。據(jù)此變化可以判斷各類化合物的結(jié)構(gòu)，這些試劑對結(jié)構(gòu)具有診斷意義，稱為診斷試劑。

  四、山楂中黃酮類化合物的測定實(shí)例

  （一）高效液相色譜法  

1.原理 

植物類樣品用石油醚脫脂后，經(jīng)甲醇加熱回流提取，以高效液相色譜法分離，在紫外檢測器360nm條件下，以保留時(shí)間定性、峰面積定量。 

2．儀器和試劑 

（1）高效液相色譜儀（2）紫外檢測器（3）層析柱（4）超聲波清洗儀 （5）索氏提取器 （6）微孔過濾器（濾膜0.45um）（7）甲醇（色譜純）（8）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（9）石油醚，鹽酸，磷酸（分析純）（10）去離子水（11）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取經(jīng)105℃干燥恒重的蘆丁標(biāo)誰品15.0mg，加甲醇溶解并定容至100ml，配成150ug／ml的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 

3. 操作步驟 

（1）樣品處理  

1）固體樣品：稱取2.0g干燥的固體樣品，研細(xì)，置于索氏提取器中，用石油醚（60～90℃）提取脂肪等脂溶性成分，棄去石油醚提取液，剩余物揮去石油醚，加人甲醇50ml和25％HC1 5ml，80℃水浴回流水解1h，取出后快速冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，甲醇定容，經(jīng)0.45um濾膜過濾，供分析用。  

2）液體樣品：準(zhǔn)確吸取樣品2.0ml，直接以石油醚萃取脫脂，揮去石油醚后， 以甲醇溶解并定容，經(jīng)微孔濾膜（0.45um）濾過后供測定用。  

（2）色譜分離條件  

色譜柱：CLC－ODS，6mm×150mm，5um;  

流動相：0.3％磷酸水溶液：甲醇（V:V）＝40:80，臨用前用超聲波脫氣； 流  速：lml／min； 柱  溫：40℃； 檢測波長：360nm； 靈敏度：0.02AUFS； 進(jìn)樣量：20ul。  

（3）樣品測定：準(zhǔn)確吸取樣品處理液和標(biāo)準(zhǔn)液各10ul，注入高液相色譜儀進(jìn)行分離，以其標(biāo)準(zhǔn)溶液峰的保留時(shí)間定性，以其峰面積計(jì)算出樣品中總黃酮的含量。4、結(jié)果計(jì)算

（二）分光光度法

1．原理  黃酮類化合物是具有苯并吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)的一類天然化合物的總稱，一般都具有4位羰基，且呈現(xiàn)黃色。黃酮類化合物的3—羥基、4—羥基或5—羥基、4－羰基或鄰二位酚羥基，與鋁鹽進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)，在堿性條件下生成紅色的絡(luò)合物。  

本方法對樣品中黃酮類化合物進(jìn)行提取純化后，用分光光度法于510nm波長下測定其吸光度，與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品比較，進(jìn)行待測物中總黃酮的定量測定。 2．儀器和試劑 （1）722分光光度計(jì) （2）索氏提取器  

（3）真空泵，鹽基交換管等。 （4）恒溫水浴，分液漏斗。 （5）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品  （6）亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉（分析純）。  （7）氯仿，無水乙醇，甲醇（分析純）。  （8）5％香草醛溶液：稱取5g香草醛，加冰乙酸溶解并定容至100ml。 （9）聚酰胺樹脂  （10）去離子水。 

3．操作步驟 （1）樣品處理  

1）固體樣品：稱取1～2g干燥的固體樣品，用濾紙包緊，置于索氏提取器中，加入50～100ml 70％乙醇溶液浸潤后，在80℃水浴下回流3h，至提取液無色為止。粗提液冷卻后，減壓抽濾，并用少量25％乙醇溶液洗滌濾渣，合并濾液。在50℃下減壓蒸餾，除去其中的乙醇，直至索氏提取器內(nèi)溶液呈無醇味。倒出容器內(nèi)溶液，用30ml熱水分3次洗滌，抽濾后，將濾液倒入分液漏斗中，以75ml 氯仿分3次萃取脫脂，待完全分層后，收集各次下層水溶液并定容至50ml。  

稱取1～2g經(jīng)預(yù)處理的聚酰胺樹脂粉末，濕法裝柱，用水飽和。吸取上述脫脂后的水溶液1～2ml，沿層析柱漫漫滴人柱內(nèi)，放置一定時(shí)間，待測液被充分吸附后，用70％乙醇或甲醇洗脫，流速為1.0ml／min，至流出液基本無色，一般收集10ml即可。上述洗出液用洗脫劑定容后即可用于測定。  

2）液體樣品：準(zhǔn)確吸取1.0ml樣品，定容至50ml后，直接以75ml 氯仿分3次萃取脫脂，其余步驟同上。  

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.50、1.00、2.00、3.00、⒋00ml（相當(dāng)于蘆丁0、75、150、300、450、600ug），移入10ml刻度比色管中，加入30％乙醇溶液至5ml，各加5％亞硝酸鈉溶液0.3ml，振搖后放置5min，加入10％硝酸鋁溶液0.3ml搖勻后放置6min，加1.0mol／L氫氧化鈉溶液2ml，用30％乙醇定容至刻度。搖勻，放置15min，于510nm波長處測定吸光度，以零管為空白，以蘆丁含量（ug）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相關(guān)系數(shù)（r）。  

（3）樣品測定：根據(jù)樣品中總黃酮含量高低，取適宜體積待測液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備操作步驟于510nm處進(jìn)行吸光度的測定（樣液如有沉淀，應(yīng)過濾后測定）。  

4.結(jié)果計(jì)算  根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，求出相當(dāng)于樣品吸光度的蘆丁含量，按下式求出總黃酮含量 

（三）紫外光分光亮度法測定

（1）對照品溶液制備

精密稱取槲皮素對照品10.0 mg，置100 mL容量瓶中，加入95%乙醇50 mL溶解，再以50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得0.1 mg/mL的對照品溶液，也即標(biāo)準(zhǔn)溶液。 

（2）供試品溶液制備 

精密稱取105℃干燥2 h的山楂約6.5015 g，置索氏提取器中，加入60%乙醇130 mL，回流提取1.5 h。將提取液定量轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，補(bǔ)加蒸餾水至刻度，搖勻，作為 供試品溶液。 

（3）測定最大吸收波長 

精密量取對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中。分別加入50%乙醇使成5 mL；精密加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；加入10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；加入1 mol/L NaOH溶液4 mL；分別用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15 min。以第1瓶和第4瓶掃描最大吸收波長，第1瓶為空白。結(jié)果見圖1

由圖1可知，λ=315 nm為最大吸收波長。 1.3.4繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 

于最大吸收波長315 nm處分別測其吸光度，以對照品濃度為橫坐標(biāo)，以吸收度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程。結(jié)果見圖2。

結(jié)果表明，槲皮素在0.000252～0.0340 mg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)。

 

參考文獻(xiàn)

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