山楂中黃酮類化合物的測定方法概述 (6)(一)

山楂中黃酮類化合物的測定方法概述 

目         錄

一、引言·······················································2

二、實驗材料··················································2

三、實驗過程··················································2

（一）黃酮的提取·············································2

（二）黃酮的純化·············································3

（三）標準曲線的繪制········································4

四、實驗結果分析·············································4

（一）山楂總黃酮純化條件的選擇···························4

（二）最大吸收波長···········································4

（三）標準曲線的繪制········································5

（四）比色條件的優化········································5

（五）方法學考察··············································6

（六）樣品測定·················································6

五、結論分析····················································7

參考文獻···························································7

一、引言

山楂，可食用植物，仁果類水果，質硬，果肉薄，味微酸澀。 落葉灌木。枝密生，有細刺，幼枝有柔毛。小枝紫褐色，老枝灰褐色。能防治心血管疾病，在中草藥中的應用歷史悠久，作為營養滋補產品備受青睞，也是大多數復合飲料的原材料，山楂含有豐富的營養成分及活性物質，主要包括β一胡蘿卜素、維生素、氨基酸和黃酮類化合物等。

本實驗采用標準曲線法測定南山植中總黃酮含量的方法，結果表明該方法靈敏度高，專屬性強，操作簡便，重現性好。

本文簡要介紹了山楂中黃酮類化合物的測定方法，重點對山楂中黃酮類化合物的提取方法進行綜述，旨在為山楂在飲料工業中的綜合利用提供參考。

二、實驗材料

1%三氯化鋁溶液；753紫外分光光度計；電熱恒溫水浴鍋；蘆丁標準溶液；氫氧化鈉溶液10 mI,。

三、 實驗過程

（一） 黃酮的提取

新鮮山碴去核、切片，曬干，制成干山碴備用。

準確稱取5g干山碴置于圓底燒瓶中，加入100mL 80%乙醇水溶液(v W)，于70℃回流提取1b重復1次，合并提取液，真空濃縮至無醇味(約20mL)，加無水乙醇定容至50 mI,搖勻，備用。

蘆丁標準溶液配制精密稱取120℃下干燥至恒重的蘆丁標準品50 mg置于250 mL容量瓶中，加60%乙醇20 mL使之溶解。再加入60%乙醇定容至刻度，搖勻，即得蘆丁標準溶液，每1 mL中含無水蘆丁0. 20 m g稱取試驗樣品，用80m1沸水沖泡5次，每次沖泡10min 。設置沖泡水量與浸提時間兩大因子，稱取試驗樣品1. 0g若干份，分別用20.40.60.80.100m1沸水沖泡，置于95℃的電熱恒溫水浴鍋中分別浸提20.30.40.50.60min。

水提法。水提法適于黃酮貳類物質提取。該法成本低、對環境及人類無毒害、設備簡單，適合工業化大生產，但提取率低，提取物中雜質較象如無機鹽、蛋白質、糖類等)，后續分離麻煩，現在很少單一使用該法。胡敏等對水提法作了改進，使所得銀杏提取物GBE中總黃酮的含量有所提高。

堿性水或堿性稀醇提取法。黃酮類化合物大多具有酚輕基，易溶于堿水，酸化后又可沉淀析出。其原因一是由于黃酮酚輕基的酸性，二是由于黃酮母核在堿性條件下開環，形成2'-輕基查耳酮，極性增大而溶解。因此可用堿性水將碳酸鈉、氫氧化鈉、氫氧化鈣水溶液)或堿性稀酸50%乙醇)浸出，浸出液經酸化后析出黃酮類化合物。氫氧化鈉水溶液的浸出能力高，但雜質較多，不利于純化。含有較多的果膠、勤液質、靴質及水溶性雜質但浸出效果不如氫氧化鈉水溶液好，同時有些黃酮類化合物能與鈣結合成不溶性物質被濾除。一般可以根據不同的原料使用不同堿性溶液。等用pH值為10的氫氧化鈉溶液從菊花中提取黃酮類物質時，效果較好。曹永剛用堿性較強的飽和石灰水從魁米中提取蘆丁，使蘆丁成鹽溶解，效果好日。一般應注意酸堿性不宜過強，以免強堿在加熱時破壞黃酮，也防止在酸化時生成鹽，使析出的黃酮又復分解.影響收得率。

提取時也宜采用石灰水，使它們與氫氧化鈣生成鈣鹽沉淀濾除。

（二）黃酮的純化

分別過濾，濾液定容至100m1備用。吸取試液(試液的制備文稿中己介紹)0. Sml，加1%三氯化鋁溶液9. 5ml，搖勻，靜置顯色10min，以試劑空白作參比，用10mm比色皿，于波長420nm測定光密度E。2.1.1聚酞胺柱層析法。

聚酞胺柱層析法分離效果好，樣品容量大，適于在制備分離工藝中應用。但洗脫速度慢，死吸附較大損失有時高達30 %)，常有低分子量酞胺的低聚物雜質混入，裝柱時用5%甲醇或10 %鹽酸預洗除去低聚物。李文魁等以甲醇一氯仿為洗脫劑，用聚酞胺層析柱對各種黃酮貳類進行分離，效果好。利用硅膠層析柱氯仿一甲醇作洗脫劑)和聚酞胺層析枚水一甲醇作洗脫劑)配合分離，從黃答中分離出11種黃酮類化合物;利用聚酞胺層析柱，水和乙醇梯度洗脫，從金錢草中分離到5種黃酮類化合物。2.1.2硅膠柱層析法。由于黃酮類化合物與硅膠有很強的吸附能力，難洗脫，而且與硅膠中很多金屬離子絡合而不能被洗脫.所以應預先用濃鹽酸處理硅膠除去金屬離子，以免干擾分離效果。硅膠主要用于分離極性較低的黃酮類化合物如異黃酮、黃烷類、二氫黃酮醇)和高度甲基化或乙酞化的黃酮和黃酮醇，如用乙醚一氯仿溶劑系統從野靛中分離異黃酮類硅膠在降活后也可用于極性較大的黃酮類化合物，如貳類、多輕基黃酮類化合物。如穿心蓮根丙酮提取物用苯一己炕洗脫得到芹菜素7，4氣二甲醚，用苯洗脫得到5-0H-7, 8, 2'-四甲氧基黃酮醇。  

葡聚糖凝膠柱層析法。葡聚糖凝膠主要有SephadexLH-2。型和Sephadex-G型)是一種淋洗速度快，可以反復使用，沒有損失的非常好的分離和純化黃酮類化合物的填充材料。其中Sephadex-LH20的洗出液中不含雜質，適用于從紙色譜分析、硅膠及聚酞胺柱色譜中分離出來的黃酮類化合物糖貳配基及糖貳的最終純化。葡聚糖凝膠在分離游離黃酮時，主要靠吸附作用，吸附程度取決于游離酚輕基的數口，游離酚輕基的數口越多越難以洗脫;在分離黃酮貳時，則分子篩的屬性起主導作用，相對分子質量的大小或含糖的多少決定化合物被洗脫的先后，分子量越大，連的糖越多，越易洗脫。如用甲醇作洗脫劑，從SephadexLH -20柱洗出下列物質先后順序為:刺槐成山蔡酚-3一半鼠李糖一鼠李糖貳)、蘆雙雙糖)、棚皮成單糖)、芹菜索5, 7, 4'-三輕基黃酮)、山蔡酸3, 5, 7, 4'-四輕基黃酮)、棚皮索3, 5, 7, 3',4'-五輕基黃酮。用葡聚糖凝膠柱層析從密蒙花中分離得到了8個黃酮類化合物。