山楂中黃酮類化合物的測(cè)定方法概述 (6)(二)

（三） 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密，吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0. 0, 2. 0, 4. 0, 6. 0, 8. 0, 10.0 mL,分別置于25 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL,搖勻后放置6m irk加100 o硝酸鋁溶液1 mI,搖勻后再放置6min加400氫氧化鈉溶液10 mI,再加60%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min在最大吸收峰510 rm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，結(jié)果見表1。用最小二乘法作線性回歸，得蘆丁濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A--12. 2875C -0. 014667,相關(guān)系數(shù)=0. 99950。

表1 不同蘆丁濃度的吸光度值

濃度/(mg1mL-1) 0.016 0.032 0.048 0.064 0.080

吸光度 0.179 0.367 0.560 0.775 0.980

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

（一） 山楂總黃酮純化條件的選擇

聚酞胺柱層析法分離效果好，樣品容量大，適于在制備分離工藝中應(yīng)用。但洗脫速度慢，死吸附較大損失有時(shí)高達(dá)30 %)，常有低分子量酞胺的低聚物雜質(zhì)混入，裝柱時(shí)用5%甲醇或10 %鹽酸預(yù)洗除去低聚物。李文魁等以甲醇一氯仿為洗脫劑，用聚酞胺層析柱對(duì)各種黃酮貳類進(jìn)行分離，效果好。高木修造等利用硅膠層析柱  氯仿-甲醇作洗脫劑和聚酞胺層析枚水一甲醇作洗脫劑)配合分離，從黃答中分離出11種黃酮類化合物;利用聚酞胺層析柱，水和乙醇梯度洗脫，從金錢草中分離到5種黃酮類化合物。

由于黃酮類化合物與硅膠有很強(qiáng)的吸附能力，難洗脫，而且與硅膠中很多金屬離子絡(luò)合而不能被洗脫.所以應(yīng)預(yù)先用濃鹽酸處理硅膠除去金屬離子.以免干擾分離效果。硅膠主要用于分離極性較低的黃酮類化合物如異黃酮、黃烷類、二氫黃酮醇)和高度甲基化或乙酞化的黃酮和黃酮醇，如用乙醚一氯仿溶劑系統(tǒng)從野靛中分離異黃酮類硅膠在降活后也可用于極性較大的黃酮類化合物，如貳類、多輕基黃酮類化合物。如穿心蓮根丙酮提取物用苯一己炕，洗脫得到二甲醚，用苯洗脫得到5-0H-7. 8. 2'-四甲氧基黃酮醇。

（二） 最大吸收波長(zhǎng)

吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，分別置于兩支10 mL比色管中，加60%乙醇至5 mI,按L 24 2方法顯色，以等量的60%乙醇作空白，顯色后，標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液分別于400 ~ 600 rrn掃描，確定其最大吸收波長(zhǎng)。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(1)和樣品溶液(2)顯色后在400 ~600 rrn掃描，得最大吸收峰分別為510 nm和500 rrn。由于樣品溶液在510 rrn和500 nm波長(zhǎng)處的吸光度差小于0 002 AU故將510 nm確定為測(cè)定波長(zhǎng)。光譜掃描曲線見圖1.

圖1 光譜掃描圖

 

（三）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確移取上述蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)溶液液o. 1. o. 2 0.3 0, 4 0, 5 0 mL分別置于6只10 mL比色管中，用60%乙醇補(bǔ)足SmL加50 o N aN02溶液0 3 mI,搖勻，再加100o A1(N03):溶液0 3 mI,搖勻，放置3m in,加1 mol/LN}H溶液4 mL和水0 4 mI,搖勻，放置10 m in,以60%乙醇水溶液為空白，于510fIn處測(cè)定吸光值，以吸光度值(A)對(duì)山碴黃酮含量(C,  mg fnL)作回歸曲線，得回歸方程。

（四）比色條件的優(yōu)化

加入N aN02溶液放置時(shí)間的選擇。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液各2 mL于具塞試管中，加入5 0 o N aN0:溶液0 3 mI,搖勻，分別放置0, 2, 3, 6 m in,其他

條件不變，測(cè)定結(jié)果見表2.

加入A1}N03 }3溶液放置時(shí)間選擇。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液2 mL于具塞試管中，加入50o NaNO:溶液0 3 mI,搖勻，立刻加入100 o A 1(N03):溶液0 3 mI,搖勻，分別放置0, 3, 4,6min,再加1 m o 1 /L N a0H溶液，測(cè)定結(jié)果見表3。

由表3可以看出，加入AI}N}3 }3溶液后的放置時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定影響，可能是鋁離子和黃酮化合物形成配合物需要一定時(shí)間才能達(dá)到穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入AI（NO3）O3溶液放置3 m in后，加入N a0H溶液，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

（五）方法學(xué)考察

5.1精密度考察

精密吸取5份2 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別放入10 mL比色管中，按L 2 4 2的方法測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD值。結(jié)果表明，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD僅為0 580，精密度良好。5.2顯色穩(wěn)定性考察

精確吸取標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液各2 mL于10 mL比色管中，按L 2 4 2的方法測(cè)定吸光度。當(dāng)顯色體系反應(yīng)完全后，每隔5 m in記錄一次吸光度值，連續(xù)30 m in考察兩者穩(wěn)定性。在30min內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光度保持不變，樣品溶液吸光度變化不大，所以選擇顯色體系反應(yīng)完全后30min內(nèi)測(cè)定其吸光度。

5.3 重現(xiàn)性考察

精確稱取Sg干山碴5份，按1 2 1方法提取和122確定的最佳條件純化后，得5份樣品溶液，各取2 mI,按1 2 4 2方法測(cè)定吸光度，代入回歸方程計(jì)算山碴總黃酮含量。 

5.4加樣回收率考察

分3組，每組做3份平行樣，均取1 mL樣品溶液于具塞試管中，分別再加入一定量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，按L 2 4 2方法測(cè)定吸光度，計(jì)算其加樣回收率。