大鼠血漿中華法林的藥物動力學研究(二)

二 材料與方法

（一） 試劑與儀器

1 藥品與試劑

   華法林鈉標準品（純度＞99.5%），華法林鈉上海信誼藥廠有限公司，（2.5mg/片），復方血栓通膠囊（廣東眾生藥業股份有限公司，0.5g/粒），甲醇、乙腈、乙酸銨、冰乙酸（均購于杭州米克化工有限公司）。

2 實驗動物

   從上海斯萊克實驗動物有限公司購買的SPF級SD雄性大鼠（體重200±20g），許可證號：SCXK(滬)2007-0005。

3 實驗儀器

   高效液相色譜系統：島津LC-20ATvp高效液相色譜儀；島津SPD-20Avp紫外-可見檢測器；大連依利特 BDS C18 column (5μm, 150 mm×4.6 mm)色譜柱；保護柱BDS C18 Precolumn (4.6 mm×12.5 mm)保護柱；分析軟件浙江智達N2000色譜工作站；T&D SCD-15柱溫箱；德國Hettich 臺式高速冷凍離心機，萊比信(中國)科技發展有限公司；DN系列氮氣吹干儀，廣州科栢實驗器材有限公司；XM-80A漩渦混合器；漢密爾頓微量進樣器 25μL，水浴鍋；分析天平；燒杯；量筒；容量瓶；移液管；灌胃針。

（二） 試驗方法

1 色譜分析方法

   日本島津shimadzu 20AT高效液相色譜系統，智達N2000色譜工作站，流動相將甲醇和pH2.8的0.05Mol/L的-醋酸銨溶液以體積比70:30的比例配置而成，配置完成之后，使用超聲波進行除汽包。流動相的洗脫速率是1.0 mL/min，柱子溫度控制在35℃，紫外檢測設定波長為308nm，采用外標法定量對華法林進行定量（華法林鈉標準品作為標準物）。

2 血漿樣品的處理與制備

   準確的量取0.1ml血漿于1.5 mL具有塞子的離心管中，并加入0.1mL的色譜乙腈，對稱的放入漩渦混合器使血漿與色譜乙腈混合均勻，放入高速冷凍離心機12000 r/min高速離心5 min后，用移液槍輕輕的吸取上清液，0.22μm濾膜過濾后，用微量進樣器吸取20 μL上清液進高效液相色譜系統分析。

3 標準曲線制備

   準確稱取華法林鈉標準品10.0mg ,小心倒入100.0mL容量瓶，加入流動相小心的沖洗杯壁以確保華法林鈉標準品全部溶解并定容至 100.0 ml ,作為儲備液使用，將儲備液用流動相分別進行稀釋1、2、10、20、100、200、1000倍，制成100.0，50.0，10.0，5.0，1.0，0.5,0.1μg/mL系列華法林納標準液，具有塞子的離心管中各加入0.9mL上述標準液，再加入空白血漿每管0.9mL，用漩渦混合器混勻后，12000 r/min高速離心5 min，用移液槍小心吸取上清液，0.22μm濾膜過濾后，進樣器吸取20 μL進上清液高效液相色譜系統分析。流動相為甲醇：0.05M醋酸銨溶液（pH2.8）=70：30（v/v），設置洗脫液流速1.0 mL/min、柱溫35℃、紫外檢測波長308nm。將進樣分析得到的藥物峰面積（Y）為縱坐標，以藥物濃度（X）為橫坐標進行線性回歸。

4 方法回收率和精密度

   利用之前的華法林納儲備液制備含藥物濃度在曲線范圍內的高、中、低濃度血漿樣品0.1，1，10 μg/mL作為質控樣品（QC），12000 r/min高速離心5 min后，吸取上清液，0.22μm濾膜過濾后，吸取20 μL上清液進高效液相色譜系統分析，每個濃度樣品重復預處理和進樣分析5次，以樣品中藥物峰面積與未經處理相同濃度的標準液的峰面積之比，計算高、中、低3種濃度下華法林監測方法的回收率。取上述高中低濃度的樣品在一天不同時間點內重復預處理和5次進樣，比較每次藥物峰面積的變化情況，計算幅度得出日內變異系數，再取上述高中低濃度樣品分別連續五天重復進樣，比較五天藥品峰面積的變化并計算出日間變異系數。

5藥物動力學研究

   實驗動物: 144只SPF級SD實驗大鼠（體重200±20g）[19]。 實驗器材: 100 ml容量瓶兩只和250ml容量瓶一只, 玻璃棒，燒杯若干，大鼠灌胃針若干只。 實驗藥品: 華法林鈉片(2. 5 mg/片, 上海信誼藥業有限公司) , 復方血栓通膠囊（0.5g/粒，廣東眾生藥業股份有限公司），蒸餾水。144只SPF級SD實驗大鼠，正常進食、進水、飼養環境溫度（26．5 ±0．5)℃、正常光照，隨機分為華法林給藥組和華法林+血栓通給藥組，進行實驗適應性飼養三天。取4片華法林納溶解在250ml蒸餾水中，制成0.04mg/ml的華法林納溶液待用。取30顆復方血栓通膠囊，拆開膠囊倒出藥物，使其溶解在100ml華法林納溶液制成華法林鈉0.04mg/ml+血栓通0.15mg/ml的混合溶液待用。分別以華法林鈉0.2mg/kg，華法林鈉0.2mg/kg+血栓通0.75g/kg，口灌給藥，于給藥后0，0.17，0.5，1.0，3.0 , 5.0, 12.0, 24.0, 48.0, 72.0, 96.0，120.0h每組6只大鼠腹主動脈采血法，分離血漿，按照上述血漿樣品處理方法進行處理，進樣分析，將求得的峰面積代入相應的標準曲線，計算出血漿中藥物濃度，繪制藥物濃度——時間曲線方程，調試3P97藥物動力學軟件并利用其計算大鼠口灌華法林后的藥物動力學參數。

三 結果

（一） 色譜圖及特異性分析

血清中華法林的色譜圖：

                            圖 3.1  標準液色譜圖

 

圖 3.2  空白血清色譜圖