葛根芩連片的含量測定研究進展(二)

葛根是葛根芩連片的君藥,葛根素是葛根的活性成份,且含量較高,有許多藥理作用,測定葛根素的含量能控制葛根芩蓮片的內在質量。譚建生通過實驗測定的4批葛根中葛根素含量,不同批次間含量差別較大,含量分布范圍在1.4%一5.8%。據此計算,初步認為葛根芩連片中葛根素含量應不低于0.7%。而秦文清的薄層色譜法測定結果也符合這一結果。

三、葛根芩連片中鹽酸小檗堿的含量測定實例

鹽酸小檗堿為《中國藥典》收載品種，含量測定《中國藥典》2005 年版二部對其原料藥采用容量法，制劑采用高效液相色譜法，有效地控制了該藥的質量。

吳永芹等人用HPLC法測定葛根芩連片中鹽酸小檗堿的含量。實驗的條件是色譜柱: Diamonsil C18,流動相:乙腈-5mmol/L十二烷基硫酸鈉溶液(冰乙酸調pH 4.0)(52:48),流速:1.0mL/min,檢測波長:348nm,理論板數按鹽酸小檗堿峰計算應不低于4500。鹽酸小檗堿在0.1008-2.52μg范圍內線性關系良好(R=1.000);平均加樣回收率(n= 9)為101. 2%。在這次試驗中研究員取供試品溶液進樣,經二極管陣列檢測器檢測后,對樣品中鹽酸小檗堿色譜峰進行單一性驗證,各值為961.5、999.8、998.6、999.2、971.0,均高于其閾值428.0，并將其在線紫外吸收光譜與對照品光譜比較,二者相同,表明鹽酸小檗堿色譜峰純度高,為單一峰,符合含量測定的要求。

江漢美等采用反相高效液相色譜法,用AgilentZORBAX SB-C18柱(4.6× 250mm,5μm),以乙腈-0.05mol/L三乙胺溶液(用磷酸調節pH至3.0)(25：75)為流動相,流速為1.0mL/min,檢測波長為347nm,柱溫為室溫。RP-HPLC法測定方中鹽酸小檗堿的含量在0.16-0.80μg范圍內線形關系良好,r=0.9993,平均加樣回收率為97.0%,RSD=1.3%。

四、葛根芩連片中黃芩苷的含量測定實例

葛根芩連片以葛根芩連湯為基礎配方制作，方出于張仲景《傷寒論》。原方為里熱挾表邪下利而設，由葛根、黃芩、黃連、甘草四味藥組成，葛根升津兼解肌發表，黃芩、黃連清熱止利，甘草和中緩急，是清熱止利，兼以解表的代表方。黃芩在其中的重要性不言而喻，黃芩苷作為黃芩的主要活性成分，其含量多少對于葛根芩連片的藥效有重要意義。

（一）間接競爭酶聯免疫分析(ELISA)法

劉姝晨等人利用黃芩苷單克隆抗體，通過考察線性關系、精密度、加樣回收率等方法學指標，建立黃芩苷的間接競爭 ELISA 法，并用所建立的方法測定7個不同廠家葛根芩連片中黃芩苷的含量。試驗中研究人員對黃芩苷間接競爭 ELISA 法進行了系列的方法學考察，結果表明以 CBS 緩沖液作為包被緩沖液，包被方式為37℃10 min＋4℃12 h，樣品pH值調制于 7．4 左右，離子強度為0．01 M 緩沖體系，競爭反應時間1 h，顯色時間15 min 條件下的靈敏度最佳。由此實驗可得建立的黃芩苷間接競爭 ELISA 法的線性范圍為16.157-1280mg/L，板間精密度RSD≤9．0%，板內精密度RSD≤5．1%，平均回收率為107．1% ( RSD=4．9%)。

含量測定結果顯示，7個廠家生產的葛根芩連片中黃芩苷含量從4．45 mg/片到 13．41 mg /片不等，差距較大，所得結果與相關 HPLC 檢測結果相符。

（二）高效液相色譜法

劉青、趙敏采用高效液相色譜法。在Kromasil C18柱(4.6mm×200mm,5μm),流動相為甲醇-0.4%磷酸水(53∶47),流速為1mL /min,檢測波長為278nm的色譜條件下黃芩苷在0.4μg-2μg范圍內呈良好的線性關系,R=0.9997,平均回收率為97.65%, RSD為2.45%(n= 5)。

王小龍的實驗中用KromaslC18色譜柱(4.6×250mm,5μm);流動相為甲醇-水-磷酸(50:50:0.2);檢測波長為276nm;柱溫是30`C;流速為2.0ml/min;進樣量:20μl;檢測波長為276nm。實驗結果如下線性范圍為0.16-1.88μg(R=0.9998),平均回收率為98.71%。此次實驗的優點有以下3點：樣品的處理簡單易行,50%甲醇溶液直接超聲30min,過濾,可作為提取方法；經比較甲醇-水-冰醋酸的分離效果,實驗所采用的流動相分離效果好,保留時間適宜；經比較用70%乙醇及流動相溶液,實驗所采用的50%甲醇溶液對樣品的提取更有利于有效成分的充分提取。

五、總結

近年來，隨著對中藥復方制劑質量標準研究的不斷深入，醫藥工作者越來越意識到中藥復方制劑的功效是藥品內含成分整體作用的體現，是多種成分、多種機制的綜合作用的結果，僅僅憑借以某一化學成分為對照的定性和定量的中藥質量控制方法，不能真正反映中藥的內在綜合質量，因此提出了中藥整體控制模式。從文獻的數據中發現，葛根芩連片中所含的成分各廠家差異顯著。究其原因除制劑過程中工藝控制的差異導致各企業產品差異外，也是目前中藥材的來源非常復雜，參差不齊，中藥材科屬不同、環境不同以及栽培、采收加工方式不同且品種繁多所致。葛根芩連片質量控制基本都采用薄層色譜法、高效液相色譜法（HPLC）、紫外分光光度法等方法測定有效成分（指標性成分）。在對葛根芩連片幾種主要組成成分含量測定方法研究進展分析中可知，由于HPLC法具有較高的分離效率和較快的分析速度，最適宜復方制劑，適用于成分復雜的多組分制劑，因此使用更為廣泛。在查找文獻資料過程中，我發現在中藥成分復雜、多環節、多靶點的作用模式下，運用各種試驗方法對葛根芩連片中的多種有效成分進行同時含量測定正在逐漸成為主流。而HPLC仍舊是應用最多的技術。其次新興的一些含量測定方法例如氣相色譜法、毛細管電泳法和一些聯用技術（如GC-MS、HPLC-MS、CE-MS等）由于可找到的文獻資料不足未在文中舉例。

參考文獻

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