葛根芩連片的含量測定研究進展(二)

江漢美等［12］采用反相高效液相色譜法，用Agilent ZORBAX SB-Cl8柱(4.6×250mm，5um)，以乙腈：0.05mol／L三乙胺溶液(用磷酸調節pH至3.0) (25：75)為流動相，檢測波長為347nm，柱溫為室溫，供試品溶液制備采用鹽酸：甲醇(1：100)溶液超聲提取30min。結果：RP—HPLC法測定方中鹽酸小檗堿的含量在0.16~0.80ug（r=0.9993）范圍內線性關系良好；重復性6份供試品溶液峰面積的RSD為2.7%；供試品溶液在12h內穩定；平均加樣回收率為97.0％，RSD為1.3％。

吳永芹等［13］采用高效液相色譜法以Diamonsil C18 (4.6×250mm，5um)為色譜柱，以乙腈：5mmol·L-1十二烷基硫酸鈉溶液(用冰乙酸調pH 4.0) (52：48) 為流動相，檢測波長為348nm，柱溫為室溫，供試品溶液制備采用鹽酸：甲醇(1：100)溶液超聲提取20min。結果：鹽酸小檗堿在0.1008~2.52ug (r=1.000)范圍內線性關系良好；重復性6份供試品溶液含量的RSD為0.92%；供試品溶液在24h內穩定；平均加樣回收率為101.2%，RSD為1.3％。

2.3 葛根芩連片中黃芩主要活性成分黃芩苷的含量測定方法

2.3.1采用 HPLC色譜法

王小龍［14］采用高效液相色譜法等度洗脫，Kromasil Cl 8 (4.6×250 mm，5um) 為色譜柱；流動相為甲醇：水：磷酸 (50：50：0.2)；檢測波長為276 nm，柱溫為30℃；供試品溶液制備采用50%甲醇超聲提取30min。結果：該方法濃度在0.16～1.88 ug( r=0.9998) 范圍內線性良好；重復性5份供試品溶液黃芩苷峰面積的RSD為1.05%；供試品溶液在5h內穩定；平均回收率為98.71%，RSD為1.15%。

劉青等［15］采用高效液相色譜法等度洗脫，以Kromasil C18柱(4.6×200mm，5um)，流動相為甲醇：0.4%磷酸水(53：47)，檢測波長為278nm，柱溫室溫，供試品溶液制備采用50%甲醇超聲提取30min。結果：黃芩苷在0.4ug～2ug范圍內呈良好的線性關系r=0.9997；重復性5份供試品溶液黃芩苷峰面積的RSD為1.61%；供試品溶液在10h內穩定；平均回收率為97.65% ，RSD為2.45%。

劉利敏等［5］采用高效液相色譜法二元梯度洗脫，色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18(5 um，4.6×250 mm)；流動相A為甲醇，流動相B為0.2％磷酸溶液，檢測波長：277 nm；柱溫為30℃；供試品溶液制備采用70%甲醇超聲提取40min。結果：黃芩苷濃度在0.1794～3.5870 ug (r=0.9999) 范圍內線性關系良好；重復性6份黃芩苷含量的RSD為0.5%；供試品溶液在40h內穩定；平均加樣回收率分別為98.7％。

2.3.2采用間接競爭ELISA法

劉姝晨等［16］采用所建立的黃芩苷間接競爭酶聯免疫分析(ELISA) 法檢測不同廠家葛根芩連片中黃芩苷的含量差異。利用黃芩苷單克隆抗體, 采用棋盤法以CBS（碳酸鹽緩沖液0.05 mol/L，pH 9.6）作為包被緩沖液，包被方式為37℃ 10 min + 4℃，12 h,樣品pH值調制于7.4左右，離子強度為0.01 M緩沖體系，競爭反應時間1 h，顯色時間15 min 條件下考察線性關系、精密度、加樣回收率等方法學指標,建立黃芩苷的間接競爭ELISA 法。結果：建立的黃芩苷間接競爭ELISA 法的線性范圍為16.157 ~1280 mg/ L，板間精密度RSD≤9.0%,板內精密度RSD≤5.1%,平均回收率為107.1%，RSD為4.9%。

2.4葛根芩連片中多種活性成分同時測定的方法

鄧開英等［4］采用高效液相色譜法，色譜柱ZORBAX Eclipse XDB C18柱(4.6×250 mm，5 um)；流動相以甲醇(A)，0.2％磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～12 min，A：B=23：77；12～15min，A：B=23：77～48：52；15～40 min，A：B=48：52)；檢測波長250 nm(0～15 min，檢測葛根素)和280 nm(1 5～40 min，檢測鹽酸小檗堿和黃芩苷)；柱溫30℃；供試品溶液制備采用70%甲醇水浴加熱回流提取30min。結果：葛根素、鹽酸小檗堿和黃芩苷分別在0.02～0.40ug（r=0.9999）、0.01～0.20ug（r=0.9999）和0.01～0.20ug（r=0.9999）范圍內線性關系良好；平均回收率分別為99.2％、97.1%和97.9％，RSD分別為1.7％、2.1％和1.9%。重復性6份供試品溶液中3種活性成分含量的RSD分別為1.2％、1.4％和1.7%；供試品溶液在12h內穩定。

吳永芹等［6］采用高效液相色譜法梯度洗脫，使用Ultimate LP-C18 (4.6×250 mm, 5um)色譜柱；流動相1%冰醋酸甲醇溶液；檢測波長：0～20min，250nm；20～45min，278nm；柱溫為35℃；供試品溶液制備采用70%乙醇超聲提取30min。結果：葛根素在0.03869～0.7738ug (r=0.99999)范圍內，黃芩苷在0.02052～0.4104ug (r=0.99999) 范圍內，線性關系良好；葛根素平均回收率為98.57％，RSD為1.6%，黃芩苷平均回收率為99.41％，RSD為1.9%；重復性6份葛根素溶液含量的RSD為0.34%，黃芩苷含量的RSD為0.26%；供試品溶液在24h內穩定；

胡曉茹等［8］采用HPLC法建立特征圖譜和含量測定方法，并以液質聯用對特征峰進行指認。采用TC-C18色譜柱(4.6×250 mm，5um)，以甲醇為流動相A，以0.15％三氟乙酸溶液為流動相B，梯度洗脫(0～25min，23％A-30％A；25～26 min，30％A-35％A；26～39 min，35％A-42％A；39～40 min，42％A-45％A；40～55 min，45％A)，檢測波長250 nm(用于特征圖譜建立和葛根素含量測定)、348 nm(用于鹽酸小檗堿含量測定)；采用電噴霧離子源進行正離子模式掃描，對葛根芩連片特征圖譜中8個特征峰進行指認。結果：建立了以葛根素和小檗堿為參照峰的葛根芩連片HPLC特征圖譜，并指認了葛根素、鹽酸小檗堿、3-羥基葛根素、3-甲氧基葛根素、葛根素木糖苷、大豆苷、鹽酸巴馬汀和黃芩苷8個特征峰；葛根素含量在8.8~12.9 mg/片之間，鹽酸小檗堿含量在2.5~7.0 mg/片之間；葛根素和鹽酸小檗堿分別在0.15～2.90ug（r=0.9999）范圍內和0.09～1.80ug（r=0.9999）范圍內，呈良好的線性；方法加標平均回收率分別為97.83%～100.2%和97.98%～99.93%，RSD分別為0.5%～1.4%和1.3%～2.6%。重復性6份供試品溶液中葛根素和鹽酸小檗堿含量的RSD分別為0.98%和1.0%；供試品溶液在24h內穩定。

李麗莉等［9］采用反相高效液相色譜法，建立葛根芩連片中14個特征性成分的HPLC含量測定方法，以Inertsil ODS-3(250×4.6mm，5um)為色譜柱，以（A）乙腈，（B）0.02mol·L-1 醋酸銨+0.O3%三乙胺溶液(用冰醋酸調pH4.3)為流動相梯度洗脫，葛根素、大豆苷、甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、大豆苷元、甘草酸銨、黃芩素8個成分檢測波長250 nm，漢黃芩素檢測波長280 nm，表小檗堿、鹽酸藥根堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿5個成分檢測波長346 nm；供試品溶液制備采用70%甲醇加熱回流30min。結果：葛根素、鹽酸小檗堿和黃芩苷分別在146.26～5850.24 ng（r=0.9993）范圍內，46.73～1869.25 ng（r=0.9998）范圍內，79.18～3167.32 ng（r=0.9996）范圍內，呈良好的線性；方法加標平均回收率分別為99.36%、101.32%和100.13%,RSD分別為2.18%、0.77%和1.68%；重復性6份供試品溶液中葛根素、鹽酸小檗堿和黃芩苷含量的RSD分別為0.68%、1.75%和1.88%；供試品溶液在23h內穩定。 

3. 總結

（1）文獻報道葛根芩連片中葛根的含量測定研究采用了高效液相（HPLC）色譜法和薄層掃描法，傳統的薄層色譜采用有機溶劑作為展開劑，一般可得到很好的分離效果，但是有機溶劑有毒、易燃和易揮發等，尤其采用混合溶劑作展開劑時，由于展開劑各組成揮發性的差異，又因提取、點樣、及儀器的影響帶來誤差，從而使實驗結果重復性差，但它可快速地進行定性分析的特點可用于葛根素的鑒別，而HPLC法與之相比含量測定準確度更高，重復性更好，樣品溶液更穩定性，適合批量產品的檢測。

（2）文獻報道葛根芩連片中黃連的含量測定研究都采用了高效液相（HPLC）色譜法，可見HPLC法測其有效成分鹽酸小檗堿的含量，簡便易行，準確度高，重現性好，可為葛根芩連片的質量控制提供有效的技術方法。

（3）文獻報道葛根芩連片中黃芩的含量測定研究采用了高效液相色譜法（HPLC）和間接競爭酶聯免疫(ELISA)分析法，ELISA法靈敏度較高，便捷、精確、重現性好，但處理樣品時間稍長，故可以作為樣品的初步篩選與初步評估方法；而HPLC色譜法能達到基線分離，陰性對照無干擾，專屬性強、準確度高及自動化的優點，可作為葛根苓連片質量控制的方法。

（4）文獻還報道了采用高效液相色譜法同時測定葛根芩連片中多種活性成分的研究，其中采用梯度洗脫和雙波長及多波長進行含量檢測已成為多數研究者的主要研究范圍，同時胡曉茹等［8］和李麗莉等［9］在建立特征圖譜的評價系統中提出了以雙標峰相對保留時間定位法進行特征峰定位。證明高效液相色譜法建立的特征圖譜更能反映樣品的真實性，文獻說明了中藥特征圖譜能較為全面地反映中藥中所含化學成分的種類與數量，是評價中藥復方制劑整體質量的有效手段。2015版中國藥典葛根芩連片中葛根和黃連有效成分的含量測定方法的制定，主要采用了胡曉茹等［8］文獻的含量檢測方法。

葛根芩連片中的主要藥物葛根、黃芩、黃連的代表性成分,葛根素、黃芩苷和鹽酸小檗堿含量的波動,可能直接造成該藥物臨床療效的不穩定。而中藥復方制劑具有多藥味多靶點的特點，所以如何建立保證中藥復方制劑質量的方法是中藥質量控制的關鍵所在。建立的特征圖譜可全面體現葛根芩連片組成成分，簡化了標準操作又節省了資源，為葛根芩連片的國家標準的制定提供了參考，為中藥特征圖譜評價系統提供新的思路。

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