葛根芩連片的含量測定研究進展

葛根芩連片的含量測定研究進展

一、葛根連片的簡介

1、主要功效

解肌清熱，止瀉止痢。

2、適用病癥

用于泄瀉痢疾，身熱煩渴，下痢臭穢；菌痢、腸炎。

3、用法用量

口服。一次3～4克，一日3次。

4、藥性分析

方中重用葛根發(fā)表解肌，升發(fā)脾胃清陽，是為君藥；黃芩、黃連清腸胃之熱邪，是為臣藥；甘草甘緩和中，并能調(diào)諸藥，是為使藥。諸藥配合成方，共奏解表清里之功。

二、有關(guān)含量測定方法的介紹

1、UV法測定

UV分光光度計是利用紫外可見吸收光譜法，根據(jù)在特定吸收波長處所測得的吸收度，來進行藥品的鑒別、純度檢查及含量測定的測量裝置。紫外可見吸收光譜法自問世以來，在應(yīng)用方面有了很大的發(fā)展，尤其是在相關(guān)學(xué)科發(fā)展的基礎(chǔ)上，促使分光光度計儀器的不斷創(chuàng)新，功能更加齊全，使得光度法的應(yīng)用更拓寬了范圍。紫外可見吸收光譜的基本原理是利用在光的照射下待測樣品內(nèi) 部的電子躍遷，電子躍遷類型有：（1）σ→σ* 躍遷 指處于成鍵軌道上的 σ 電子吸收光子后被激發(fā)躍遷到 σ* 反鍵軌道（2）n→σ* 躍遷 指分子中處于非鍵軌道上的 n 電子吸收能量后向 σ*反鍵軌 道的躍（3）π→π* 躍遷 指不飽和鍵中的 π 電子吸收光波能量后躍遷到 π*反鍵軌 道。（4）n→π* 躍遷 指分子中處于非鍵軌道上的 n 電子吸收能量后向 π*反鍵軌 道的躍遷 。電子躍遷類型不同，實際躍遷需要的能量不同： σ→σ* ～150nm n→σ* ～200nm π→π* ～200nm n→π* ～300nm 　吸收能量的次序為：σ→σ*>n→σ*≥π→π*>n→π* 　特殊的結(jié)構(gòu)就會有特殊的電子躍遷，對應(yīng)著不同的能量（波長），反反映在紫 外可見吸收光譜圖上就有一定位置一定強度的吸收峰，根據(jù)吸收峰的位置和強度就可 以推知待測樣品的結(jié)構(gòu)信息。

2、HPLC法測定

高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)應(yīng)用。

高效液相色譜法有“四高一廣”的特點：

①高壓：流動相為液體，流經(jīng)色譜柱時，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓。

②高速：分析速度快、載液流速快，較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個樣品在15～30分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時。

③高效：分離效能高。可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。

④高靈敏度：紫外檢測器可達0.01ng，進樣量在μL數(shù)量級。

⑤應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢。

⑥柱子可反復(fù)使用：用一根柱子可分離不同化合物

⑦樣品量少、容易回收：樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。

此外高效液相色譜還有色譜柱可反復(fù)使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點，但也有缺點，與氣相色譜相比各有所長，相互補充。高效液相色譜的缺點是有“柱外效應(yīng)”。在從進樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間（進樣器、柱接頭、連接管和檢測池等）中，如果流動相的流型有變化，被分離物質(zhì)的任何擴散和滯留都會顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜。

三、葛根芩連片含量測定的實例

葛根

照高效液相色譜法（2010年版藥典一部附錄Ⅵ D）測定。

 1、色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇－乙腈－水（6：10：84）為流動相；檢測波長為250nm。理論板數(shù)按葛根素峰計算應(yīng)不低于2500。

2、 對照品溶液的制備

取葛根素對照品適量，精密稱定，加甲醇－水（70：30）的混合溶液制成每1ml含0.15mg的溶液，即得。

3、供試品溶液的制備

取本品10片，包衣片除去包衣[1]，精密稱定，研細，取0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇－水（70：30）的混合溶液50ml，稱定重量，加熱回流30分鐘，放冷，再稱定重量，用上述混合溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

4、測定法

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。

本品每片含葛根以葛根素（C21H20O9）計，不得少于9.6mg。

黃連

照高效液相色譜法（2010年版藥典一部附錄Ⅵ D）測定。

1、色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈－5mmol/L十二烷基硫酸鈉溶液（用冰醋酸調(diào)節(jié)至pH 4.0）（52：48）為流動相；檢測波長為348nm。理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計算應(yīng)不低于4500。

2、對照品溶液的制備

取鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加甲醇－鹽酸（100：1）的混合溶液制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。

3、供試品溶液的制備

取本品10片，包衣片除去包衣[1]，精密稱定，研細，取0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇－鹽酸（100：1）的混合溶液20ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率180W，頻率35kHz）20分鐘，放冷，再稱定重量，用上述混合溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

 4、測定法

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。

1 實驗部分

　　1.1 儀器

　　Waters 2695高效液相色譜儀(Waters2996二極管陣列檢測器，Empower色譜工作站)，超聲波清洗器(KQ2200DB，40kHz，80W，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);混合纖維素酯微孔濾膜(孔徑：0.45μm)，電子分析天平(Sartorius BS 224 S), SZ-93自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)。

　　1.2 試劑與材料

　　甲醇(色譜純，20070315112)，乙醇(分析純，20070827093)，黃芩苷對照品由中國藥品生物制品鑒定所提供(批號110715-200212，供含量測定使用)，水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。葛根芩連片(河南禹州市藥王制藥有限公司，批號分別為081005、081010、081012)。

　　2 方法與結(jié)果

　　2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性考察

　　Agilent ZORBAX SB-C18 (Stable Bond Analytical 4.6×250mm，5μm)色譜柱;流動相：甲醇-0.2%磷酸水(50：50)，流速：1ml /min，柱溫30℃，檢測波長280nm，在此色譜條件下，理論塔板數(shù)大于7000，分離度大于1.5，進樣量為10μl。

　　2.2 對照品溶液的制備

　　精密稱取黃芩苷對照品適量，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.483mg/ml的黃芩苷對照品溶液。

　　2.3 供試品溶液的制備

　　取供試品10片，研細，混勻，精密稱取相當(dāng)于平均每片的樣品重量，置50ml容量瓶中，精密加入70%乙醇50ml，搖勻，稱定重量，超聲處理(功率200W，頻率50Hz)30min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。以上所配溶液的HPLC色譜圖見圖1。圖1 樣品HPLC色譜圖

　　黃芩苷對照品(A)、供試品(B)及陰性樣品、(C)HPLC色譜圖

　　光譜純度分析及樣品中黃芩苷色譜峰定位分析：選擇與黃芩苷對照品相對應(yīng)的色譜峰進行光學(xué)純度分析，以保證此色譜峰的光譜純度較高，沒有共流物的出現(xiàn)。

　　PDA光譜純度分析設(shè)定波長為210～400nm全波段掃描。由以上四個光譜純度分析圖上可以看出：在供試品11.050min的色譜峰位置與黃芩苷對照品光譜有較大相似，如圖2、圖3;將兩者光譜重疊得到PDA光譜區(qū)別圖(如圖4)，由圖4中可以看出，區(qū)別曲線在0.000范圍內(nèi)波動較小，并且由PDA數(shù)據(jù)校正產(chǎn)生純度與閾值角度上來看 (如圖5) ，PDA光譜匹配角度為0.678，PDA匹配的閾值角度為1.272，光譜匹配角度<匹配的閾值角度，說明該色譜由較高光譜純度;由PDA光譜純度分析圖中可以看出，自動閾值角度>色譜純度角，說明該色譜峰的光譜純度較高，沒有光譜共流物的出現(xiàn)，可以作為樣品中黃芩苷進行定量分析。

　　2.4 線性關(guān)系考察

　　分別精密吸取“2.2”項下的黃芩苷對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，分別置于25ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成系列濃度的對照品溶液，按上述色譜條件進樣，記錄色譜，以峰面積為縱坐標(biāo)，以黃芩苷濃度為橫坐標(biāo)進行回歸計算，得線性回歸方程為Y=2.82×104X～9.24×104，r =0.9998(n=5),結(jié)果表明在19.32～96.60μg/ml范圍內(nèi)與黃芩苷的峰面積呈良好的線性關(guān)系。圖2 黃芩苷對照品PDA光譜圖圖3 供試品在11.050min色譜的光譜圖圖4 對照品與供試品PDA光譜區(qū)別圖圖5 PDA光譜純度分析圖

　　2.5 精密度試驗

　　精密吸取對照品溶液10μl，重復(fù)進樣5次，并進行測定，測定其RSD為0.75%，表明精密度良好。

　　2.6 穩(wěn)定性試驗

　　按“2.3”項下供試品溶液的制備方法，制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10μl，立即進樣，分別于0、4、8、16、24、48、72h進樣，測定其RSD值為0.83%(n=6)，結(jié)果表明，供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

　　2.7 重復(fù)性試驗

　　按“2.3”項下供試品溶液的制備方法，制備供試品溶液，制備5份供試液，精密吸取供試品溶液10μl，并進行測定，RSD為0.91%(n=5)，說明供試品溶液的重復(fù)性良好。

　　2.8 加樣回收試驗

　　取葛根芩連片(批號 081012)10片，按照“2.3”項下制備供試品溶液，制備同時加入適量對照品溶液，用70%乙醇稀釋至刻度，再取0.5ml此溶液至10ml容量瓶中，加入甲醇定容，進行測定，記錄色譜，計算其RSD=0.62%(n=6)，其結(jié)果見表1。　表1 加樣回收率實驗

　　2.9 黃芩苷的含量測定

取3個不同批號的葛根芩連片按“2.3”項下制備供試品溶液，分別進樣10μl，測定(n=3)，取三次測定平均值。

【參考文獻】

  　1 國家藥典委員會.中國藥典，2005年版一部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005: 211-212.

　　2 溫華珍,肖盛元,王義明,等.黃芩化學(xué)成分及炮制學(xué)研究.天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2004, 16(6): 575-580.