王不留行抗人肝癌細胞株HepG2的作用研究(二)

2.1.3常用試劑配置

消化液的配制：雙蒸水配制胰酶消化液，組成為胰酶0.25%，EDTA，NaCl0.8%，KCl0.02%，Na2HPO4·12H2O0.35%，KH2PO40.02%，溶解后超凈臺內經0.22μm濾膜無菌過濾，分裝后置-20℃保存。

PBS配制：以雙蒸水配制，組成為NaCl0.8%，KCl0.02%，Na2HPO4·12H2O0.35%，KH2PO40.02%，經0.45μm濾膜過濾后121℃高壓滅菌15min，4℃保存。

MTT溶液：以PBS配制濃度為5mg/mL的MTT溶液，超凈臺內經0.22μm濾膜無菌過濾，15mL分裝，-20℃避光保存。

2.1.4試驗用細胞株

人肝癌細胞HepG2

2.2實驗方法

2.2.1王不留行活性餾分制備過程

王不留行干燥根莖經60%乙醇回流提取3次，每次2小時，提取液濃縮后經石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇依次萃取。取提取物20mg，加入100μL生物級DMSO溶解，配制成濃度為200mg/mL的儲備液，4℃保存。

2.2.2粗提物及正丁醇層對HepG2細胞生長抑制活性檢測（MTT法）

取對數生長期的HepG2細胞，接種于96孔培養板中，細胞密度為1×104個/mL，每孔加入100μL，置37℃，5%CO2孵箱中培養12h，使貼壁。分別加入100μL不同濃度的阿霉素(ADR)、王不留行粗提物、正丁醇層，每個濃度設3個復孔，置37℃、5%CO2孵箱中培養24h。每孔加入MTT(5mg/mL)20μL，繼續在孵箱中孵育4h。棄去上清，每孔加入150μLDMSO，于490nm處測定吸光值(OD值)。分別計算不同藥物抑制細胞生長的IC50，并按下列公式計算抑制率(InhibitionRate，IR%)。

IR%=(空白對照OD-樣品OD)/(空白對照OD-空白調零OD)×100%

2.2.3正丁醇萃取層對HepG2細胞凋亡活性的形態學觀察（Hoechst染色）

取處于對數生長期的細胞，以2×105個/mL接種于6孔板中，2mL/well。細胞置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養12h，使細胞貼壁。將正丁醇層提取物儲備液用培養基稀釋，使其終濃度依次為12.5，25，50,100μg/mL。每個濃度的藥物設3個復孔，每個6孔板分別設3個空白對照組。在室溫、避光的條件下，加入Hoechst染色孵育，結束后，棄去含染料的培養基，用預冷的PBS清洗2遍。將6孔板置于熒光顯微鏡上，調節熒光模塊，按一定順序觀察細胞形態變化，拍照。

2.2.4正丁醇萃取層對HepG2細胞胞內活性氧（ROS）生成的影響

取對數生長期HepG2細胞，消化后計數板計數，調整細胞密度為1.0×105個/mL，接種于6孔細胞培養板內，2mL/well，置于37℃、5％CO2培養箱孵育，待細胞貼壁后給予加藥處理，給藥12h后進行DCFH-DA探針的裝載并收集細胞進行檢測，具體操作步驟如下：按照1:1000用無血清培養液稀釋DCFH-DA。去除上清培養液，用PBS洗1-2次，每孔加入2mL稀釋好的DCFH-DA，37℃培養箱內孵育30min后，再用PBS洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。胰酶正常消化后收集細胞于流式檢測管內，應用流式細胞儀進行ROS釋放量檢測。

2.2.5正丁醇萃取層對HepG2細胞凋亡活性的影響

取對數生長期的細胞以2×105個/mL密度接種于6孔板中，2mL/well。細胞置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養12h，使細胞貼壁。將正丁醇層提取物儲備液用培養基稀釋，使其終濃度依次為20，40，60μg/mL。每個濃度的藥物設3個復孔，每個6孔板分別設3個空白對照組。將6孔板中的舊培養基棄去，空白組加入2mL含有10%FBS的新鮮培養基，加藥組分別加入含有對應濃度藥物的培養基，2mL/well。放入細胞培養箱中繼續培養一定時間。孵育結束后，將舊培養基轉置于15mL離心筒，每孔用預冷PBS清洗2遍，將細胞用適量0.25%胰酶充分消化后加入舊培養基，吹打均勻后轉置于15mL離心筒，在4℃、3000rpm的條件下離心10min之后用PBS充分重懸、清洗細胞，于4℃、2000rpm的條件下再次離心10min。棄去上清液，每個離心筒加入500μLBindingBuffer重懸細胞后轉置于流式管中，每管分別加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI工作液，渦旋混勻，400目濾網過濾使細胞成單細胞懸液，室溫、避光、反應5~15min后利用流式細胞儀檢測。

3實驗結果

王不留行粗提物及正丁醇層的體外抗腫瘤活性考察，選取了人肝癌細胞株HepG2，藥物對HepG2細胞株作用24h后的抑制率結果，見表3.1-A及表3.1-B。結果顯示：隨著給藥濃度的增加，藥物對HepG2細胞株的抑制率增加。結果表明：王不留行粗提物及正丁醇層對人肝癌細胞株HepG2有呈劑量依賴型的增殖抑制作用。   

表3.1粗提物(A)及正丁醇萃取層(B)對HepG2細胞的抗增殖作用(IR,mean±SD,n=3)

藥物濃度(μg/ml) 12.5 25 50 100

IR(%) 15.72±0.37 22.87±2.16 44.18±0.36 72.34±0.21

   A:

藥物濃度(μg/ml) 12.5 25 50 100

IR(%) 22.35±0.43 38.31±0.47 50.33±0.75 85.41±0.53

    B:

對照組HepG2細胞呈梭形或不規則形，上皮性貼壁生長，細胞均質而透明，一般具有2-4個核仁，核膜、核仁輪廓明顯，細胞間結構緊密，細胞生長旺盛。正丁醇層作用24h后，細胞數量明顯減少，細胞間隙變寬。部分早期凋亡細胞出現冒泡現象，核膜及細胞膜清晰可見，細胞變圓浮起，胞質中顆粒增多，染色質濃縮，固縮成斑塊狀，有明顯的凋亡小體產生。如圖所示

     

             正丁醇萃取層對HepG2細胞株作用的形態學觀察

  （A：12.5μg/ml；B：25μg/ml；C:50μg/ml;D：100μg/ml）

根據流式細胞儀檢測結果Fig.3.3可以看出，經正丁醇層藥物處理24h后，HepG2細胞的ROS釋放量顯著增加，即正丁醇層提取物可以濃度依賴性的促進HepG2細胞內ROS的生成。

細胞形態學觀察結果顯示，正丁醇層可誘導HepG2細胞產生明顯的凋亡跡象。因此，采用AnnexinV-FITC流式細胞術進一步檢測正丁醇層對HepG2細胞凋亡的影響。選取了12.5、25、50、100μg/mL四個濃度的藥物分別與HepG2細胞作用24h之后，用AnnexinV-PI雙染法對細胞進行染色，收集樣品上機檢測。各濃度的雙染結果見圖。結果顯示：隨著藥物濃度的增加，正丁醇層促進AnnexinV及PI陽性細胞率增加。結果說明：正丁醇層可誘導HepG2細胞凋亡，且呈濃度依賴型

   

 正丁醇萃取層對HepG2細胞胞凋亡活性的影響

4.實驗小結

癌癥的發病率及死亡率一直呈上升趨勢，現已成為全世界面臨的最嚴重的公共問題之一。本研究選取了人肝癌細胞株HepG2，對王不留行及其正丁醇層的體外抗腫瘤活性進行考察。得出結論：王不留行及其正丁醇層對人肝癌細胞株HepG2的增殖抑制作用呈劑量依賴性。由于正丁醇層提取物對HepG2細胞株的抑制作用最明顯，具有進一步研究的價值，故最終選取王不留行正丁醇層作為進一步的活性研究和機制探討的測試藥物。

為了進一步驗證王不留行正丁醇層對腫瘤細胞株的增殖抑制作用機制，選取了人肝癌細胞株HepG2細胞系，對正丁醇層的體外抗腫瘤活性進行機制探討。通過Hoechest33258染色法觀察細胞形態學改變、ROS生成實驗考察對細胞胞內活性氧生成的影響、AnnexinV-PI雙染法檢測細胞凋亡率考察了王不留行正丁醇層誘導HepG2細胞的凋亡作用。

綜上所述，本課題為王不留行的抗腫瘤臨床應用提供了新的參考，對王不留行進行的體外抑制肝癌細胞增殖實驗研究提供了一定的參考。

三、參考文獻

[1]夏明星,張蓮芬,王一君,等.王不留行提取物對內皮細胞增殖、遷移及其黏附的作用評價[J].中國藥理學通報,2009,25(6):817-819.

[2]夏明星,馮磊,張蓮芬,等.王不留行中抗人微血管內皮細胞增殖的有效組分的分離和純化[J].生物技術通報,2009,2:93-97.

[3]李生華 常見果實種子類中藥材鑒別. 北方藥學, 2013 (1) :16-17

[4]桑圣民，夏增華，毛士龍，等.中藥王不留行中黃酮甙類成分的研究［J］.中國中藥雜志，2000，25（4）：221-222.

[5]桑圣民，勞愛娜，王洪誠，等．中藥王不留行化學成分的研究(I)．天然產物研究與開發，1998，10(4)：1-4．

[6]桑圣民，勞愛娜，王洪誠，等．中藥王不留行化學成分的研究(11)．中草藥，2000，31(3)：169—171．

[7]桑圣民,毛士龍,勞愛娜,等 中藥王不留行化學成分的研究（111） . 天然產物研究與開發, 2000 ,12 (3) :12-15