三份野生蕎麥POD、CAT、EST的同工酶譜分析(一)

三份野生蕎麥POD、CAT、EST的同工酶譜分析（黑體三號、居中）
生物科學  2002級  張明坤（宋體小四號、居中）
指導教師  吳  琦  副教授（宋體小四號、居中）
摘 要（宋體小四號、加粗、頂格）：采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）對三份野生蕎麥根、莖和葉的過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和酯酶（EST）的同工酶進行了酶譜分析。結果顯示，POD和EST都檢測到5條譜帶，包括POD-1、POD-2、POD-3、POD-4及POD-5，其中POD-3及POD-4在所有組織中都存在，但在苦蕎麥1號中的帶最強；POD-1只在金蕎麥葉片及金蕎麥1號莖中出現；POD-2在莖組織及苦蕎麥1號根中存在，但在金蕎麥及苦蕎麥中的位置不同；POD-5存在于葉片及苦蕎麥1號莖中，在苦蕎麥的帶較強。EST-1及EST-2只出現在金蕎麥2號莖和葉中，EST-3和EST-5只存在于葉片中，并且在金蕎麥1號中的帶最強，EST-4存在于莖和葉片，在金蕎麥1號最強；CAT只有3條帶，其中CAT-1出現在葉片中，在苦蕎麥1號及金蕎麥1號表達較強；CAT-2出在現在莖和葉片，并且莖、葉位置不同；CAT-3只存在于葉片中，非常微弱。分析表明，供試的三份野生蕎麥的同工酶表達，具有明顯的組織間差異和種間差異。（中文用楷體小四號、英文用Times New Roman小四號、兩端對齊）
關鍵詞（宋體小四號、加粗、頂格）：蕎麥，同工酶分析，過氧化物酶，過氧化氫酶，酯酶（楷體小四號、兩端對齊）（關鍵詞間，用逗號隔開）
Zymogram Analysis of POD, CAT and EST Isoenzymes
from Three Wild Buckwheat（Times New Roman三號、居中）
ZHANG Ming-kun  Biological Science, Grade 2002（Times New Roman小四號、居中）
Directed by  WU Qi (Associate Prof. Ph. D) （Times New Roman小四號、居中）
Abstract（Times New Roman小四號、加粗、頂格）:Using the vertical polyacrylamide gel electophoresis, the differentiation of peroxide(POD), catalase(CAT) and esterase(EST) isoenzyme from roots, caudexes and leaves of three wild buckwheat were analyzed. The results showed that five bands including POD-1, POD-2, POD-3, POD-4 and POD-5 were detected in the gel of POD as well as EST-1, EST-2, EST-3, EST4 and EST-5 for EST. POD-3 and POD-4 were common in all the tissues, but most intensive in F. tartaricum. POD-2 was only discovered in the leaves of F. cymosum and caudex of F. cymosum 1. Although there was some difference between the location, POD-2 appeared in the caudexes of three buckwheat and root of F. tartaricum. POD-5 was detected in all leaves and caudx of F. tartaricum, moreover, it was  much more obvious in tissues of F. tartaricum. EST-1 and EST-2 existed in leaf and caudex of  F. cymosum 2. EST-3 and EST-5 were found in all the tested leaves and the bands in F. cymosum 1 were clearest. For CAT, only 3 bands were detected in all tissues, CAT-1 appeared in the leaves of three buckwheat and clearer in F. cymosum and F. cymosum 1. CAT-2 was detected in different location in leaves and caudexes. CAT-3 existed in the leaves though it was unclear. The results of analysis showed difference in quantity and intensity of the band among all isoenzymes during the tested species and tissues.（Times New Roman小四號、兩端對齊）
Keywords（Times New Roman小四號、加粗、頂格）: Buckwheat, Analysis of Isoenzymes, POD, CAT, EST（Times New Roman小四號、兩端對齊）
 同工酶的概念早在1895年，由Fischer提出[1]（引文序號用Times New Roman小四號，上標）。現在一般認為，同工酶是指同一種酶的多種分子形式。這些不同的分子形式具有相同或相似的底物，催化相同的反應[2]（引文序號用Times New Roman小四號，上標）。同工酶是基因表達的產物，在一定程度上反映生物的系統發生，因此，利用同工酶分析技術，從分子水平、從遺傳背景方面來尋找植物種類間的親緣關系，較能彌補形態分類的不足[3-5]（連續引用多篇引文序號用Times New Roman小四號，X-Y, 上標）。同工酶在進化中具有一定的保守性，受基因控制，在一定程度上反映生物的系統發生[6]。同工酶標記是屬于生化標記之一，它作為基因表達的直接產物，其結構的多樣性在一定程度上可以反映出生物遺傳物質DNA組成上的差異。（中文用宋體小四號、英文用Times New Roman小四號、段前縮進2個漢字，兩端對齊）
 蕎麥(Buckwheat)屬于蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum）的雙子葉植物，起源于喜馬拉雅山系東側即我國西南地區。目前，我國已發現的蕎麥有10個種和2個變種，分別為蕎麥、苦蕎麥、金蕎麥、硬枝野蕎麥、長柄野蕎麥、小野蕎麥、線葉野蕎麥、細柄野蕎麥、巖野蕎麥和疏穗野生蕎麥等[7]，資源極為豐富。與其它作物相比，蕎麥具有較高的營養價值，已被作為一種集營養、保健、醫藥，飼料、蜜源等為一體的多用型作物而在世界各地被廣泛種植。
 蕎麥是一種古老而未被充分研究利用的農作物，與其它作物相比，蕎麥各方面的研究都還比較落后。近幾十年來，隨著蕎麥研究逐步被重視，有關蕎麥的研究取得了較大的進展。國內外學者對蕎麥起源、分類、生理生化、育種及遺傳多樣性等方面都做了較多的研究[3,7-9,10]（連續引用多篇引文序號用Times New Roman小四號，X-Y，之間用逗號隔開，上標）。本研究選擇三份野生蕎麥不同組織的POD、CAT及EST三個特征性較強的同工酶，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析，旨在揭示這三份野生同工酶在所選材料不同組織分布的差異性，并為不同種蕎麥間的同工酶研究積累材料。
1 材料與方法（中文用宋體四號、英文用Times New Roman四號、加粗，頂格、兩端對齊，序號后空1格，不用標點符號）
1.1 供試材料（中文用宋體小四號、英文用Times New Roman小四號、加粗，頂格、兩端對齊，序號間用圓點隔開，最后空1格，不再用標點符號）
 苦蕎麥（F. tartaricum）：由四川烹飪高等專科學校唐宇教授提供。
 金蕎麥1（F. cymosum)，金蕎麥2（F. cymosum)：四川農業大學生物化學與分子生物學實驗室提供。
 將蕎麥種子在45℃浸泡1h，再移至25℃恒溫箱中無光照培養，待其根長至2cm左右時，移栽到農田（四川農業大學農場氣象站內）里并加以管理，待蕎麥植成熟時，即可取其根、莖、葉提取樣品備用。
1.2 儀器設備（中文用宋體小四號、英文用Times New Roman小四號、加粗，頂格、兩端對齊，數字間用圓點隔開，最后空1格，不再用標點符號）
 恒溫培養箱、瓷質研缽、高速臺式冷凍離心機（Thermo Electron Corporation）、冰箱、DYY-Ⅲ-6B型穩流穩壓電泳儀（北京六一儀器廠）、DYY-Ⅲ型垂直板電泳槽（北京六一儀器廠）、電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）、制冰機、50μL微量進樣器、凝膠成像系統（BIO-RAD Laboratories-Segrate Italy）。
1.3 方法（中文用宋體小四號、英文用Times New Roman小四號、加粗，頂格、兩端對齊，數字間用圓點隔開，最后空1格，不再用標點符號）
1.3.1 不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳（中文用宋體小四號、英文用Times New Roman小四號、加粗，頂格、兩端對齊，數字間用圓點隔開，最后空1格，不再用標點符號）
1.3.1.1 凝膠貯液及電極緩沖液的配制
 以下各種試劑的配制，參考趙永芳[10]和王曉麗[11]等的方法。
 30%Acr-Bis溶液：稱取30g丙烯酰胺（Acr）、0.8g 甲叉雙丙烯酰胺（Bis）用雙蒸水定容至100mL，充分溶解后，用濾紙過濾裝入棕色瓶，并置于4℃冰箱中保存。
 1.3.1.2 凝膠制備及電泳
 分離膠：分離膠（10％）成分見下表，按順序取以下各種成分，加入小燒杯中，混勻并緩緩倒入膠室，避免產生氣泡，膠液加至距玻璃板頂部約3 cm處，然后將膠室垂直放置，并用膠頭滴管在分離膠上表面緩緩加入0.5 cm左右的水層。10-20 min后，可以看到膠與水之間有一清晰的界面出現，此時分離膠已聚合，可以繼續加入濃縮膠。
表1 分離膠組成（表格采用三線表）

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