水楊酸合成酶AmS的異源表達、純化以及生化性質鑒定

水楊酸合成酶AmS的異源表達、純化以及生化性質鑒定

摘要

水楊酸合成酶，作為鐵螯合劑生物合成的基本模塊，可以充當一個比較有潛力的抗菌藥物靶點。

我們從Amycolatopsis methanolica 239T鐵螯合劑生物合成途徑中發現了一種新型的水楊酸合成酶，AmS。系統發育分析表明，水楊酸合成酶的多樣性較高。同時，我們發現這個水楊酸合成酶是一類比較新的類型。分析表明，AmS和Irp9以及MbtI的氨基酸序列有比較低的相似性，但是它們的活性位點是高度保守的。我們對AmS進行大腸桿菌異源表達，純化以及進行體外實驗初步鑒定其性質。實驗表明，AmS的最適pH為8.0，最適溫度為40 ℃。在低溫下，AmS的活性pH范圍比較窄，為pH=7-9。AmS催化分支酸形成水楊酸的Km值為323.8 μM，kcat為3.35 min-1，表明其和已報道的水楊酸合成酶比較，具有更低的底物選擇性，但是速率還是和其他的持平。最重要的是，AmS表現出對有機溶劑和非離子型去垢劑較強的耐受性。

我們對AmS的研究不僅為水楊酸合成酶家族提供了一個新的成員，而且還通過對其部分性質的研究闡明了水楊酸合成酶潛在的應用前景。

關鍵詞：鐵螯合劑，水楊酸合成酶，藥物靶點，動力學參數

Abstract

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目錄

1緒論1

1.1 課題背景及目的1

1.2 國內外研究狀況3

1.3 課題研究方法4

1.4 論文構成及主要內容4

2研究方案5

2.1 研究目標5

2.2 材料及方法5

2.2.1 儀器5

2.2.2 材料6

2.2.3 試劑6

2.3 實驗內容6

2.3.1 amS基因與同類基因比對6

2.3.2 引物設計7

2.3.3 表達載體構建7

2.3.4 蛋白表達與純化10

2.3.5 生化性質鑒定13

3實驗結果15

3.1 amS基因比對15

3.2 引物設計16

3.3 表達載體構建17

3.4 蛋白表達與純化19

3.5 生化性質鑒定20

4討論24

5展望26

結論27

致謝28

參考文獻29

研究成果30

附錄A  CTAB法提取放線菌基因組30

附錄B 鎳柱活化32

附錄C 乙醇沉淀32

附錄D 引物設計原則32

附錄F 實驗原始數據34