模擬微重力效應(yīng)對大鼠成骨細(xì)胞Fzd9表達(dá)的影響

模擬微重力效應(yīng)對大鼠成骨細(xì)胞Fzd9表達(dá)的影響

摘    要

長時間的太空飛行由于人體處于微重力環(huán)境，會導(dǎo)致宇航員出現(xiàn)嚴(yán)重的骨丟失現(xiàn)象，成骨細(xì)胞骨形成作用的減少是骨丟失的一個重要原因。成骨細(xì)胞中Wnt信號通路是調(diào)控骨形成的一個非常重要的信號通路，而Fzd9是存在于細(xì)胞膜上的Wnt蛋白的重要受體蛋白。在成骨誘導(dǎo)分化早期，所有Fzd成員中僅有Fzd9表達(dá)上升。敲除Fzd9基因的小鼠會表現(xiàn)出明顯的低骨量，顯示出Fzd9在成骨骨形成方面的重要調(diào)控作用，但在微重力導(dǎo)致的骨丟失中Fzd9起到什么作用還是未知的。本項目利用原代培養(yǎng)的大鼠成骨細(xì)胞，以單軸回轉(zhuǎn)器對細(xì)胞加載模擬微重力效應(yīng)，利用RT-PCR、Real Time-PCR和Western blotting等方法，研究了成骨細(xì)胞中Fzd9基因水平和蛋白水平的表達(dá)變化情況，發(fā)現(xiàn)隨著加載模擬微重力效應(yīng)的時間增加，F(xiàn)zd9的相對表達(dá)量在基因水平和蛋白水平均有顯著性的降低。我們還發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞ALP的活力隨著加載時間的延長而降低，表明其成骨能力也降低了，與Fzd9的表達(dá)量降低相一致，由此我們的實驗結(jié)果證實了Fzd9在微重力引起的骨丟失中可能存在著重要調(diào)控作用，為探索微重力環(huán)境骨丟失機制打下基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：模擬微重力效應(yīng)，成骨細(xì)胞，骨丟失，F(xiàn)zd9

Abstract

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目     錄

1緒論1

1.1課題背景1

1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀2

2實驗方案設(shè)計8

2.1實驗?zāi)康?span>8

2.2實驗方案設(shè)計及論證8

3實驗材料13

3.1動物材料13

3.2主要試劑13

3.3主要設(shè)備14

3.4主要試劑配制15

3.5引物16

4實驗方法17

4.1細(xì)胞培養(yǎng)17

4.2成骨細(xì)胞的鑒定18

4.3加載模擬微重力效應(yīng)19

4.4成骨能力的檢測19

4.5基因水平的檢測20

4.6蛋白水平的檢測23

5數(shù)據(jù)處理27

5.1RT-PCR圖片處理27

5.2Real Time-PCR圖片處理29

5.3BCA法中蛋白濃度的計算30

5.4ALP活力的計算30

5.5Western blotting圖片處理31

6結(jié)果及分析32

6.1成骨細(xì)胞形態(tài)的變化32

6.2成骨細(xì)胞的鑒定33

6.3加載模擬微重力后細(xì)胞成骨能力的變化33

6.4RT-PCR結(jié)果34

6.5Real Time-PCR結(jié)果35

6.6Western blotting結(jié)果36

7討論37

結(jié)論39

致謝40

參考文獻(xiàn)41