黃連及其制劑中生物堿類化合物的HPLC測定方法概述(二)

（一）原理簡介

高效液相色譜（HPLC）法是以高壓下的液體為流動相，并采用顆粒極細的高效固定相的柱色譜分離技術。由于與固定相(stationary phase)發生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。 色譜法最早是由俄國植物學家茨維特在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時發現的，色譜法因之得名。后來在此基礎上發展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。

高效液相色譜對樣品的適用性廣，不受分析對象揮發性和熱穩定性的限制，因而彌補了氣相色譜法的不足。據2004年統計，世界上化合物總數多達4700多萬種，可用氣相色譜分析（GC）的約占20%，而80%則需用高效液相色譜(HPLC)來分析。

高效液相色譜（HPLC）特別適用于高沸點、大分子、強極性和熱穩定性差的化合物及生物活性物質的分離和分析，并且可以制備。

因其獨特高效的提取效率，廣泛應用于藥物的提取中，包括解熱鎮痛藥、鎮靜藥、甾體藥、抗菌藥、中草藥等其它藥物。

(二)、HPLC的特點

1、高壓-壓力可達150~300Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 Kg/cm2以上。

2、高速-流速為0.1~10.0 ml/min。

3、高效-可達5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達100種。

4、高靈敏度-紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。

5、HPLC與經典液相色譜相比有以下優點：

6、速度快-通常分析一個樣品在15~30 min，有些樣品甚至在5 min內即可完成。

7、分辨率高-可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。

8、靈敏度高-紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學檢測器可達0.1pg。

9、柱子可反復使用-用一根色譜柱可分離不同的化合物。

10、樣品量少，容易回收-樣品經過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。

三、黃連及其制劑中生物堿類化合物的HPLC測定實例

（一）、復方黃連膠囊中小檗堿的測定

    復方黃連膠囊由黃連、連翹、防風、川芎等多味藥組成，具有散風清熱、瀉火止痛的功效。主治濕熱蘊毒所致的痢疾、黃疸，癥見發熱，黃疸，吐瀉，納呆，尿黃如茶，目赤吞酸，牙齦腫痛，或大便膿血。

1、儀器和材料

    美國惠普HP1100高效液相色譜儀，HP1100工作站；鹽酸小檗堿對照品（中國生物制品檢定所，批號20190107，供含量測定用）。復方黃連膠囊為安徽中醫藥大學第一附屬醫院藥學部自制，批號分別為190325，乙腈為色譜純。

2、方法

色譜柱為依利特BP色譜柱（4.6mmX200mm,5um）；柱溫40℃；流動相為乙腈-磷酸二氫鈉溶液（pH=5.0）；流速為1.0ml/min；檢測波長為268nm。

精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，用純化水配置為鹽酸小檗堿0.0034mg/ml的對照品溶液。取復方黃連膠囊內容物1.6g，置錐形瓶中，加入鹽酸-甲醇（1:100）50ml，密塞，稱定重量，超聲30min，放冷再稱定重量，用鹽酸-甲醇（1:100）補足減失的重量，搖勻，取上清液用微孔濾膜（0.45um）濾過，取過濾液。

取鹽酸小檗堿對照品溶液，分別進樣3、5、10、15、25ul注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測定。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。

精密稱取供試品（批號190325）0.80g,按前述方法制備供試品溶液，精密吸取10ul，每隔一定時間進樣，測定鹽酸小檗堿峰面積。同批號樣品3份進樣，測定峰面積。

分別精密吸取對照樣品溶液和供試品溶液各10ul，注入液相色譜儀，測定。

3、結果

鹽酸小檗堿的回歸方程為Y=2874.2X+17.224,決定系數r=0.9999。復方黃連膠囊中的小檗堿含量如下。

【表1】

樣品批號 鹽酸小檗堿含量mg 回歸率（%）

190325 0.032 100.14

0.034 100.42

0.032 99.18

4、討論

在實驗中，對實驗中鹽酸小檗堿對照品溶液，在200-400mm分別進行光譜掃描，各成分在268mm處吸收值較大，靈敏度較高，故選擇其為測定波長。本研究所建方法簡便準確，重現性好。

（二）、一清顆粒中鹽酸中小檗堿的測定

    一清顆粒為藥典方，為臨床常用藥，功效為清熱瀉火解毒，化瘀涼血止血。全方由黃連、大黃、黃芩三味中藥組成。

1、儀器和材料

    美國惠普HP1100高效液相色譜儀，HP1100工作站；鹽酸小檗堿對照品（中國生物制品檢定所，批號20190107，供含量測定用）。批號190507一清顆粒從安徽國勝大藥房購入，乙腈為色譜純。

2、方法和樣品測定

    色譜柱為依利特BP色譜柱（4.6mmX200mm,5um）；柱溫40℃；流動相為乙腈-磷酸二氫鈉溶液（pH=5.0）（28:72）；流速為1.0ml/min；檢測波長為268nm。

    對照品溶液的配制，稱取鹽酸小檗堿對照品5.12mg，置于25ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.205mg/ml的對照品溶液。

    供試品溶液的制備，取顆粒少許，精密稱取粉末2.0g,置500ml燒杯中，加沸水約300ml使溶解，放冷后加入稀鹽酸3ml,搖勻，轉移至500ml量瓶中，加水至刻度，搖勻并高速離心，精密量取上清液4ml，置50ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻即得。

    精密吸取上述對照品溶液1、2、3、4、5ml，分別置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。分別吸取上述5種溶液各10ul，進行分析2次，記錄色譜圖，用平均峰面積（Y）對鹽酸小檗堿質量（ug）回歸分析，得回歸方程Y=15440.3X+0.5，決定系數r=0.9998,表明硝酸小檗堿0.205-1.025ug范圍內具有良好的線性關系。

    分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10ul，按上述色譜條件實驗，測定峰面積，以外標法計算供試品溶液中鹽酸小檗堿的含量。通過計算，批號190503的一清顆粒中鹽酸小檗堿含量為2.90mg/g;批號190507的一清顆粒中鹽酸小檗堿含量為2.83mg/g；批號190511的一清顆粒中鹽酸小檗堿含量為2.78mg/g。

3、討論

    通過實驗表明文中供試品溶液制備方法能把供試品中的鹽酸小檗堿完全提出，分離效果好、雜質峰少，可以作為該試劑中鹽酸小檗堿含量的測定方法。

（三）、消糖靈膠囊中鹽酸中小檗堿的測定

    消糖靈膠囊是由人參、黃連、天花粉、杜仲、枸杞等中藥加優降糖組成的方劑，具有益氣養陰、清熱瀉火等功效。

1、儀器和材料

    美國惠普HP1100高效液相色譜儀，HP1100工作站；鹽酸小檗堿對照品（中國生物制品檢定所，批號20190107，供含量測定用）。消糖靈膠囊從安徽廣濟大藥房購入，乙腈為色譜純。

2、方法和樣品測定

    色譜柱為依利特BP色譜柱（4.6mmX200mm,5um）；柱溫40℃；流動相為乙腈-磷酸二氫鈉溶液（pH=5.0）（28:72）；流速為1.0ml/min；檢測波長為265nm。

    對照品溶液的配制，稱取鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇溶解并稀釋至0.4mg/ml的溶液，搖勻，即得對照品溶液。

    供試品溶液的制備，取顆粒少許，精密稱取內容物5.0g,研細，精密稱取0.5-1.0g,置于50ml燒杯中，加鹽酸-甲醇（1:100）40ml，超聲處理30min,加甲醇至刻度，過濾，搖勻，即得供試品溶液。

    精密吸取上述對照品溶液2、4、6、8、10、20ul以此進樣，測定峰面積，用平均峰面積（Y）對鹽酸小檗堿質量（mg）回歸分析,得回歸方程Y=3682.4X+15.65，決定系數r=0.9999，表明鹽酸小檗堿在0.08mg-0.8mg范圍內線性關系良好。

    分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10ul，按上述色譜條件實驗，測定峰面積，以外標法計算供試品溶液中鹽酸小檗堿的含量。通過計算，批號190601的消糖靈膠囊中鹽酸小檗堿含量為1.33mg/g;批號190608的消糖靈膠囊中鹽酸小檗堿含量為1.40mg/g；批號190610的消糖靈膠囊中鹽酸小檗堿含量為1.22mg/g。

3、討論

通過實驗表明文中供試品溶液制備方法能把供試品中的鹽酸小檗堿完全提出，分離效果好、雜質峰少，可以作為該試劑中鹽酸小檗堿含量的測定方法。

四、參考文獻

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