電場刺激下皮層神經細胞內DCC分子基因表達的研究

電場刺激下皮層神經細胞內DCC分子基因表達的研究

摘要

目的  根據建立的新生SD大鼠皮層神經元原代體外培養的方法培養皮層神經元，并對培養成熟的神經元做免疫熒光染色，以鑒定所培養的神經元。對所培養的神經元在不同電壓下加載不同時間，明確不同條件電場刺激下神經導向分子受體DCC分子的基因表達水平。為研究電場與神經導向生長的分子機制奠定基礎。方法 對體外培養的皮層神經元在電壓為50mV、100mV條件下分別加載2h和4h，并對電場加載的神經元進行Tubulin-Ⅲ免疫熒光染色觀察神經元在不同電場條件下的形態變化以及軸突長度的變化；以及通過RT-PCR以及Realtime PCR獲取DCC分子的基因表達情況，確定DCC分子基因表達的最佳條件，為后續神經導向生長機制提供依據。結果 原代皮層神經元在體外培養情況下，7天可達最好細胞狀態。電場刺激下神經元的軸突長度都有顯著性地增加，DCC分子在電壓為50mV條件下加載4h基因表達顯著增加。結論 成功體外培養原代皮層神經元，初步確定了DCC分子基因表達最佳的電場刺激條件，具有一定實際意義和應用價值。

關鍵詞：神經細胞的原代培養、電場加載、免疫熒光染色、DCC受體、RT-PCR

Abstract

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目錄

1緒論1

1.1 概述1

1.1.1 神經系統的功能與組成1

1.1.2 神經細胞培養1

1.1.3 神經細胞鑒定的主要方法2

1.2 課題背景3

1.2.1 神經損傷及修復3

1.2.2 神經導向生長5

1.3 研究目的8

1.4 論文構成及研究內容8

2實驗材料和方法10

2.1 實驗材料與設備10

2.1.1 實驗藥品10

2.1.2 實驗器材10

2.1.3 實驗動物10

2.2 大鼠皮層神經細胞原代培養10

2.2.1 手術器械的高壓消毒10

2.2.2 DMEM高糖培養基過濾滅菌11

2.2.3 細胞培養流程11

2.3 電場加載實驗12

2.4 免疫熒光染色12

2.4.1 準備細胞12

2.4.2 染色流程12

2.5 FDA（Fluorescein diacetate 乙酰熒光素）染色13

2.5.1 配制染色所需的試劑13

2.5.2 染色步驟13

2.6 RT-PCR檢測DCC分子14

2.6.1 總RNA的提取14

2.6.2 反轉錄合成cDNA15

2.6.3 PCR反應16

2.6.4 DNA電泳檢測16

2.7 Realtime PCR檢測DCC分子基因表達17

3實驗結果與討論18

3.1 神經細胞原代培養18

3.1.1 培養初期神經細胞18

3.1.2 培養中期神經細胞18

3.1.3 培養后期神經細胞19

3.2 神經元染色結果19

3.2.1 Tubulin-Ⅲ免疫熒光染色20

3.2.2 DAPI核染以及疊加結果22

3.2.3 FDA染色結果24

3.2.4 不同電刺激電壓及刺激時間條件下神經元軸突長度變化24

3.3 RT-PCR檢測DCC分子基因表達25

3.3.1 所有實驗組RT-PCR結果25

3.3.2 RT-PCR灰度值統計結果25

3.4 Real time PCR檢測DCC分子基因表達結果28

4結論與展望29

致謝31

參考文獻32