谷氨酰胺轉胺酶生產與應用

一   前言
 1谷氨酞胺轉胺酶簡介
 谷氨酞胺轉胺酶（ Transglutaminase. E . C . 2 . 3 . 2 . 13 ，簡稱 TGase ）是一種催化酞基轉移反應的酶．通過催化各種蛋白質分子之間或者分子內部形成。ε-（γ-谷氨酸）賴氨酸鍵，從而提高蛋白質的功能特性和營養價值,
 人們最初在豚鼠肝臟中發現了這種酞基轉移酶．隨后在植物、無脊椎動物、兩棲動物、魚類、鳥類中都發現了 TGase ．但是這類 TGase 來源稀少，分離提純工藝復雜，導致酶的價格十分昂貴不能用于食品工業．后來人們從微生物中提取到了這種酶，微生物來源的 TGase 催化活性不依賴 Ca2+ , 且提取工藝較簡單，加之微生物易于大規模培養，已經得到廣泛關注．
 2谷氨酰胺酶的應用
 2.1 在肉制品加工中的應用
 肉制品是人們獲得蛋白質的重要來源，而肉制品加工是食品工業中的一個重要部分。由于肉制品的高的價格和人們對蛋白質充分利用的需要， 人們總是希望能利用動物體的一切可利用部分制成肉制品， 其中面臨的一個問題是如何將一些低價值的碎肉進行重組，改善其外觀、結構、風味， 以提高其營養價值和市場價值。谷氨酰胺轉胺酶由于可以形成蛋白質分子內和分子間的交聯， 因而在肉制品重組中得到廣泛的應用， 這也是目前利用該酶最多的行業。人們通過研究發現在體外多種蛋白質可作為谷氨酰胺轉胺酶的底物發生交聯反應，包括乳清蛋白 、大豆蛋白、肌球蛋白和酪蛋白㈣等等。由于肌球蛋白是肉類中的重要蛋白， 而谷氨酰胺轉胺酶能使肌球蛋白發生交聯， 所以能夠改善肉類的質構。對于蛋白質溶液， 由于蛋白質分子發生交聯時會將水分子包裹在其中， 因而會發生凝膠化作用。Kim 等用谷氨酰胺轉胺酶處理牛肌動球蛋白溶液， 然后用SDS—PAGE進行分離并用光密度法檢測條帶， 發現交聯聚合的肌球蛋白從處理前的10.1±2.2％ 增加到20.7±3 5％，而未發生聚合的肌球蛋白單體則從未處理前的20.9±3.4％ 下降至處理后的13.0±2.7％ ，可見谷氨酰胺轉胺酶催化的交聯聚合作用比較明顯。同時用共焦激光掃描顯微鏡還觀察到了肌球蛋白凝膠的形成。由谷氨酰胺轉胺酶催化的在蛋白質分子內和分子間形成的異肽鍵屬于共價鍵， 在一般的非酶催化條件下很難斷裂， 所以用該酶處理碎肉使成形后雖經冷凍、切片、烹飪也不會重新散開。肉類蛋白質之間發生交聯后，使得肉制品更加富有彈性， 形成良好的口感， 而該酶對肉制品的其他風味不會產生影響。大量的試驗證明用谷氨酰胺轉胺酶處理的食品對人是安全的 事實上， 由于谷氨酰胺轉胺酶廣泛的存在于動物組織， 人們一直就在食用含有ε-（γ-谷氨酸）賴氨酸異肽鍵的食物，谷氨酰賴氨酸完全能夠被人體吸收利用。不僅如此， 賴氨酸是人體8種必需氨基酸之一， 也是在食品加工過程中最容易損失掉的一種氨基酸． 美拉德反應等多種食品加工過程中的副反應都會造成其損失，所以賴氨酸常成為食品中的限制性氨基酸， 而ε-（γ-谷氨酸）賴氨酸異肽鍵的生成恰恰可以防止賴氨酸發生副反應。
 2.2 在乳制品中的應用
 乳制品中的α一酪蛋白， β一酪蛋白，κ一酪蛋白以及 α一乳清蛋白， β一乳球蛋白等都是谷氨酰胺轉胺酶的良好的底物， 因而谷氨酰胺轉胺酶在乳制品工業中也有很高的應用價值 。該酶能夠在較寬的pH 范圍內(pH6．5～8．0) 對乳品蛋白質進行交聯。谷氨酰胺轉胺酶在乳制品中的應用有：(1) 在奶酪生產中， 經谷氨酰胺轉胺酶處理后， 可使乳清蛋白和酪蛋白發生交聯， 可以提高奶酪的產量。用該酶處理牛奶可以增加其粘性。(2)將谷氨酰胺轉胺酶交聯過的酪蛋白脫水后可得到水不溶性的薄膜 ， 這種薄膜能夠被胰凝乳蛋白酶分解， 因而是一種可食用性的膜， 能夠用作食品包裝材料等。(3)另據報道，谷氨酰胺轉胺酶還可用于催化α一酪蛋白交聯形成網絡狀結構，并將各種酶包裹在此網絡結構中， 事實上， 交聯的酪蛋白網絡被用作了酶固定化的載體， 經這種固定化處理的酶能反復使用而不喪失活性。在谷氨酰胺轉胺酶催化下，各種酶本身能與酪蛋白交聯， 形成一種在可溶性一不溶性之間相互轉化的酶催化系統。這些對于酶催化的理論和應用研究都是非常有意義的。
 2.3 向蛋白質分子引入限制性氨基酸
 各種不同類型的蛋白質的氨基酸組成是各不相同的，組成蛋白質的20種常見氨基酸中有8種是人體自身不能合成的必需氨基酸。如果某些蛋白質的必需氨基酸含量很低，那么它們的營養價值也低。特別是賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸等， 本身含量就不高， 而且在食品加工過程中還非常容易遭到破壞， 因而成為食品中的限制性氨基酸限制了食品的營養價值。谷氨酰胺轉胺酶不僅能催化蛋白質分子內的谷氨酰胺殘基和賴氨酸殘基之間生成異肽鍵交聯，還能催化蛋白質分子內的谷氨酰胺殘基和小分子的伯胺發生縮合連接。人們正是利用這一性質試圖將小分子的氨基酸連接到蛋白質分子上去。不過為了達到這一目的，必須設法阻斷蛋白質分子內部和分子之間發生谷氨酰胺殘基和賴氨酸殘基的交聯反應， 因為這種反應會大大影響到氨基酸與蛋白質分子內谷氨酰胺殘基的結合。利用馬來酐對蛋白質分子中的賴氨酸殘基的ε～氨基進行馬來酰化修飾，可以有效的阻斷蛋白質分子內和分子間的交聯反應“”。有些蛋白質如牛血清白蛋白、卵清蛋白由于分子構象的關系， 無論是谷氨酰胺殘基還是賴氨酸殘基都接觸不到谷氨酰胺轉胺酶， 因而不是該酶的合適的底物，但是經過馬來酰化修飾后由于構象發生變化， 谷氨酰胺殘基暴露在外． 谷氨酰胺轉胺酶能夠催化其與氨基酸之間的連接反應。當蛋白質分子連上氨基酸后， 調節pH 至酸性范圍內即可除去馬來�；�。以L一甲硫氨酸乙酯作為底物． 谷氨酰胺轉胺酶分別催化 α一酪蛋白、 β一酪蛋白、7S和1 1S大豆蛋白與之反應． 反應后這JL種蛋白質的甲硫氨酸含量分別比反應前增加了200％ 、15O％ 、240％ 和350％ ” 。用L一賴氨酸處理麥谷蛋白． 賴氨酸的含量比處理前增加了5.1倍。由此可見， 這是一種向氨基酸組成不理想的蛋白質中引入限制性氨基酸， 提高其營養價值的有效手段。
 2.4 蛋白質分子的去酰胺化
 當沒有伯胺存在時， 水將作為氨基受體， 谷氨酰胺轉胺酶催化蛋白質的谷氨酰胺殘基發生水解生成谷氨酸。由于谷氨酰胺是不帶電荷的中性氨基酸， 而谷氨酸是帶負電荷的酸性氨基酸， 因此這種水解必然導致蛋白質的性質變化。一般來說．蛋白質去酰胺化后等電點將發生變化， 同時伴隨著溶解性和對鈣離子穩定性的提高。Nonaka等人的研究發現雖然來源于微生物的谷氨酰胺轉胺酶對 酪蛋白的去酰胺化作用不如來源于兒內亞豬肝臟的谷氨酰胺轉胺酶．但還是能明顯改善蛋白質的溶解性和對鈣離子的敏感性。他們還用脫乙酰幾丁質顆粒對谷氨酰胺轉胺酶進行了固定化研究， 發現固定化的酶不能作用于 α一酪蛋白、β一酪蛋白，但可以使二甲基酪蛋白、檸康�；�的7S大豆球蛋白發生去酰胺化作用，可見這是與蛋白質的構象有關的。谷氨酰胺轉胺酶只在沒有伯胺存在時才催化谷氨酰胺殘基的水解， 因而在進行去酰胺化時必須阻斷蛋白質分子中的賴氨酸的ε一氨基以及基質中的其它氨基． 以防止蛋白質分子內部和分子之間發生交聯． 以及蛋白質的谷氨酰胺殘基和基質中的伯胺連接。但是目前還缺乏經濟安全的方法阻斷基質中的氨基， 而固定化酶的方法效果也不理想．所以在食品行業中目前還沒有廣‘泛采用該酶來對蛋白質進行去酰胺化反應。2．5 其他應用除了上述幾種應用外． 谷氨酰胺轉胺酶還能應用于很多方面。谷氨酰胺轉胺酶不僅可以催化同種蛋白質之間的交聯，還能催化不同蛋白質之間的交聯。各種蛋白質的氨基酸組成互不相同． 因而不同的蛋白質中的限制性氨基酸不一定相同， 通過谷氨酰胺轉胺酶將它們連接起來， 可以達到優勢互補的效果．提高蛋白質的營養價值。Kurth等人“在常溫和中性pH 下利用谷氨酰胺轉胺酶將非肉類的大豆蛋白、酪蛋白、谷蛋白連接到肉類肌球蛋白上。除此之外谷氨酰胺轉胺酶作用于蛋白質后， 會明顯提高蛋白質的溶解性、對酸穩定性、發泡性、乳化性、乳化穩定性等等
 
 3谷氨酰胺轉胺酶的作用特點：
 谷氨酰胺轉胺酶是一種催化酰基轉移反應的轉移酶， 它以肽鏈中谷氨酰胺殘基的一羧酰胺基作為�；�供體， 而�；�受體可以是：
 多肽鏈中賴氨酸殘基的ε一氨基， 形成蛋白質分子內和分子間的ε-（γ-谷氨酸）賴氨酸異肽鍵(圖la)， 使蛋白質分子發生交聯， 從而改變食物的質構， 改善蛋白質的溶解性、起泡性、乳化性等許多物理性質；
(2)  伯胺基， 形成蛋白質分子和小分子伯胺之間的連接(圖lb)，利用該反應可以將一些限制性氨基酸引入蛋白質以提高其營養價值；
(3) 水， 當不存在伯胺時， 水會成為�；�受體， 其結果是谷氨酰胺殘基脫去氨基生成谷氨酸殘基(圖1c)． 該反應可用于改變蛋白質的等電點及溶解度

 4 谷氨轉胺酶的來源
 長期以來，人們獲得谷氨酰胺轉胺酶的方法主要是從動物組織中提取， 如豚鼠、幾內亞豬、兔子的肝臟、魚組織等， 由于來源稀少、分離提純工藝復雜， 導致該酶的價格十分昂貴， 不可能應用于食品工業 直到80年代末， 利用微生物發酵法生產谷氨酰胺轉胺酶見諸報道。1989年，Ando等人。 報道了他們從5000株菌株中篩選出Strepto—verticilium S-8112，Streptoverticilium sp.，Streptoverticilium griseocaneun， Streptoverticilium cinnam onen subp．Cinnam oneum和Streptoverticilium mobaraense能夠以發酵法生產谷氨酰胺轉胺酶， 后來人們發現鏈霉菌屬中的其它一些菌株也能生產此酶，并對發酵過程進行了優化， 使得酶產量有了大幅度的提高， 為食品工業利用此酶創造了條件。微生物來源的谷氨酰胺轉胺酶與動物來源的酶有著類似的催化性質，但在氨基酸組成、酶學性質等方面存在著比較大的差異。來自Streptoverticilium屬的谷氨酰胺轉胺酶是一種胞外酶， 相對分子質量在40KD 左右， 活性中心包含一個游離的Cys巰基， 與動物來源的谷氨酰胺轉胺酶相比，微生物來源的酶表現出很多優勢：
(1) 對鈣離子的非依賴性；
(2) 對熱、pH 的穩定性都明顯優于動物來源的酶；
(3)更有利于保存， 經離心和過濾后的發酵液濾液在-20℃ 下可以貯存幾個月，而酶活性僅損失10％，而經過純化的酶則更加穩定。所有這些對該酶在工業過程中的使用都是很有利的。但是值得注意的是不同來源的酶對底物的專一性是有所不同的。

二  生產分離工藝
 國外對谷氨酰胺轉胺酶的研究較多也較為深入，而我國則報道很少。已報道的制備方法主要有①從動植物組織中提取，② 由微生物發酵法生產。在這里我所介紹的方法是第二種：利用微生物發酵來規模化生產。
1 菌種來源及生產原料
發酵中使用的菌種Streptoverticilium mobaraense
碳源：葡萄糖、蔗糖、淀粉等；
氮源：無機和有機氮，如：硫酸銨、尿素、大米、玉米、酵母膏等；
還需要礦物質及微量元素，如：P，Mg，K，Zn，Fe及維生素。如果需要，還需加人非離子型表面活性劑。另外，由于合成這種酶的特異性．發酵液 離 分離為提高其產量及其酶活，據文獻記載可能還需補充一些氨基酸，具體成分無法得知。
2 生產工藝
 整個發酵過程為好氧發酵，因此必需通氧并進行適當的攪拌。微生物生長和酶形成的溫度在25℃ ～35℃之問，發酵時問由培養條件及谷氨酰胺轉胺酶所達到的最高酶活決定，一般在2～4天。微生物谷氨酰胺轉胺酶是一種胞外酶，溶解在發酵液中，因此發酵結束后，需對發酵液進行離心分離，除去菌體，然后對上清液進行分離提純處理，和其它酶的純化處理過程相似。通常應用在其它酶處理過程的技術，如：離子交換、色譜、紙層析、超濾等常應用在谷氨酰胺轉胺酶的處理純化中，并且常將這些方法有機結合使用，以提高酶的純度和分離效率。最后如有必要，可以向酶中加人酶穩定劑。
3 分離純化
 Ando等人 和Motoki等人最早對谷氨酰胺轉胺酶的生產以及分離和純化過程進行了報道。將微生物接種在100ml培養基中pH7．0，30℃ 時培養48小時，然后將發酵液加到20升的新培養基中，通氣l0升／min，轉速250rpm，30℃時培養三天，發酵液酶活性范圍0．28-2．50u／ml，由所用菌種決定。下游過程如圖2所示。經過這樣的處理后，酶被純化了l74倍，酶活的總回收率為42％。
 近年來，Geber等人對純化谷氨酰胺轉胺酶的提取分離過程進行改進。在發酵液被離心和過濾之后，一次性通過一個強酸性(Fractogel EMD)離子變換劑樹脂，就可以得到純化了128倍的谷氨酰胺轉胺酶，酶活的平均回收達60％。該法選擇性較強，分離效果好，酶活性損失少，且經過這樣處理后，酶較為穩定，并且不需要加人穩定劑。
 通過對氨基酸代謝的分析，利用質量平衡，朱揚 提出某些氨基酸成為細胞生長和分泌谷氨酰胺轉胺酶產品的瓶頸效應，因此培養基中還需補充適量的氨基酸，在Ando等人設計的培養基基礎上，補充適量His，lie，和Met。利用這樣的介質對微生物進行批量發酵時，谷氨酰胺轉胺酶產量增加了4倍。

三   如何提高谷氨酰胺酶的穩定性。
    利用1994年gerben的方法進行提純的時候，因為谷氨酰胺酶的穩定性較強，因此不需要加入穩定劑或進行化學修飾。但是為了便于回收利用并且提高酶的活性，可以用下列原理進行固定化處理。具體介紹如下：
1   吸附法
 利用形成離子鍵、物理吸附等方法，將酶固定在纖維素、瓊脂糖等多糖或多孔玻璃、離子交換樹脂等載體上的固定方式。Mojovic等閻將從Candidarugosa(Candida sp．為念珠菌屬)中提取的脂肪酶吸附固定在大孔共聚物載體上在最優條件下最大吸附量為15.4mg／g，酶固定效率為62％。動力學研究表明，脂肪酶是通過局部化學反應選擇固定在載體上。在卵磷脂(異辛烷)存在下，固定酶水解椰子油，酶活力為游離酶的70％，重復使用15次后，固定酶活性仍保持其最初活性的56％。Kamata等同在恒溫30℃、24h條件下的水溶液中，將胰蛋白酶和α-淀粉酶固定在珠狀糖基蛋白上，實驗過程無任何化學改性，所獲得的固定化酶相對于固定在陰離子交換劑(器)或脫乙酰幾丁質上的酶，有較長的生命周期。任廣智等研究了磁性殼聚糖微球對脲酶的吸附固定，結果表明，磁性殼聚糖微球對脲酶的固載量與其粒徑交聯度及酶溶液的離子強度成反比，固定化脲酶的最適反應溫度為80℃，比游離酶提高了10℃，固定化脲酶的最適pH值變化不大。
2   共價鍵合法
 先借助于一些方法，在載體上引進一活潑基團，然后，此活潑基團再與酶分子上的某一基團反應，形成共價鍵的方法 。該方法常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等，其中戊二醛應用最廣泛，有研究認為其反應屬于動力學二級反應 。
3   包埋法
 主要分為凝膠包埋法和微膠囊包埋法。凝膠包埋法是將酶或酶菌體包埋在凝膠內部的微孔中，而微膠包埋法是將酶包埋在高分子半透膜中。Markvicheva等將細胞或酶包埋固定在大孔復合聚（N-乙烯基己內酰胺）-藻酸鈣(PVCL—CaAlg)水凝膠上，并研究了固定酶的熱穩定性和儲存穩定性以及酶在水(有機)介質中的性能，實驗表明，酶在65℃～80℃仍可使用，而天然酶在50℃～55℃時就完全失活。
4   新型固定化技術
 有人分別采用輻照聚合法和引發聚合法。以丙烯胺為單體，NN一亞甲基雙丙烯酰胺為交聯劑制備聚丙烯酰胺凝膠。在水合肼和Na2B O，存在制得聚丙烯酰胺固定酶。
 酶固定化過程中所應用的載體有以下幾種，必須通過實驗后才能確定哪一種載體更適合于這種酶使用。
1有機高分子載體
 主要有天然高分子載體材料和合成的高分子載體材料。天然高分子載體材料一般無毒性，傳質性能好，但是強度低。常見的有瓊脂、海藻酸鈉、殼聚糖等。Subra．manian等用經CNBr活化和堿處理過的纖維素載體固定青霉素�；�酶(PA)，青霉素�；�酶的固定化效率為80％～85％。當青霉素G的濃度高于80g／L時，未觀察到底物和產物對固定化酶的抑制作用。在40~C時，固定化酶裂解60g／L的青霉素G鉀鹽10次以上，沒有觀察到活性損失。PA固定后，活性為4．3U／g，在水解反應中，催化活性可保持10h，隨后出現了明顯的下降 。Guisan等 最先報道了表面富含醛基的瓊脂糖對PA的固定化作用，固定化酶經"' ~_NaBH4處理后用于6一APA的生產。在此基礎上，他們又研制出了乙酰基一Sepharose CL凝膠，固定化酶的活性和穩定性進一步得到提高。對瓊脂糖凝膠固定PA的機理性研究發現，瓊脂糖凝膠中的醛基可使酶以多點共價結合的方式被固定，結合酶的能力很強，可制備活性高的固定化PA，固定化酶的活性高達200U／gt 。合成的高分子載體材料主要有聚丙烯氰類、聚丙烯酰胺、凝膠聚丙烯酸類聚合物等。徐冠珠等 對PA在聚丙烯纖維上的固定化進行了許多的研究。將巨大芽孢桿菌青霉素�；�酶以共價結合的方式偶聯于聚丙烯腈纖維載體制成固定化PA，應用于水解青霉素G$IJ備6-APA，活性高達2000U／g，重復使用20次，保留活性的80％。固定化酶催化合成頭孢氨芐的活性達153U／g，重復使用50批次，保留活性為83．9％。
2．2無機載體
 早期采用的無機載體材料有膨潤土、氧化鋁和玻璃等。這些材料能與酶吸附結合，但結合酶的能力頗低，載體結合酶的量往往低于lmg。后采用表面功能化的二氧化硅凝膠和微球、陶瓷、三氧化二鋁 、海藻石和大孔玻璃等固定PA，但由于受到載體材料的孔徑、比表面積、顆粒粒度等因素的限制，固定化酶的活性難以得到很大的提高。近年來，材料科學的迅速發展拓寬了無機載體固定化PA的研究，特別是以離子型層狀材料和介孔分子篩固定化PA形成了新的亮點。層狀材料因其在化學結構上的特殊性為固定化酶的研究者提供了新思路 。它一般是由正電性的板層與層問負電性的陰離子構成的無機材料，陰離子可與其它陰離子交換而達到調節板層間距的效果，它能夠通過控制反應調節層問可反應性基團含量，使其對酶分子具有良好的親和性，有利于酶活性的保持和壽命的延長。還有一種應用比較廣泛的無機載體是介孔分子篩，M41s系列中孔分子篩是1992年美國Mobile公司的研究人員首次使用烷基季銨鹽型陽離子表面活性劑為模板劑合成的新型沸石材料 ，具有1．3nm～30nm可調的較大孔徑、高的比表面積、較小的擴散阻力、孑暾面富含弱酸性的羥基閉。介孔分子篩固定化酶一般是以載體與酶分子之間的氫鍵作用或修飾后與酶分子共價結合來實現。
2．3復合載體
 利用有機聚合物載體鍵合蛋白能力強、易成型及無機聚合物載體剛性的大孔結構特點，可使二者結合成復合載體。Baha 研究表明，磁性體Fe o4與聚苯乙烯含醛化合物一起混合可以制得磁性載體，其固定化葡萄糖氧化酶保留活性可達70％。Hofmann等用N一異丙基丙烯酰胺同丙烯酰胺共聚得到熱可塑性凝膠載體，通過載體上的琥珀酰亞胺酶固定在該載體上，通過溫度來調節其膨脹和聚沉。