聚丙烯酰胺凝膠電泳分離乳酸脫氫酶同工酶（活性染色鑒定法）

摘要：同工酶是指能催化同一種化學反應，但其酶蛋白本身的分子結構組成卻有所不同的一組酶。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定同工酶，方法簡便，靈敏度高，重現性強，測定結果便于觀察、記錄和保存。本試驗采用連續PAGE法分離LDH及其同工酶，并掌握電泳技術的原理、方法、裝置、凝膠配制等知識，熟悉主要的操作過程，同時對同工酶有一個感性的認識。
關鍵字：聚丙烯酰胺凝膠電泳、乳酸脫氫酶同工酶、分離

 帶電粒子在電場中向與其自身帶相反電荷的電極移動，這種現象稱為電泳。近幾十年來，電泳作為一項有效的分析、分離和制備技術發展很快，在生產、科研和醫療工作中得到了廣泛應用。用電泳技術分離、分析蛋白質、酶、核酸等生物大分子，有較高的分辨率，目前已成為生物科學研究中必不可少的手段之一。
 
 聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為載體的一種區帶電泳。這種凝膠是以丙烯酰胺單體（Acrylamide，簡寫為Acr）和交聯劑N，N'-甲叉雙丙烯酰胺（N,N'-Methylena Bisacrylamide，簡寫為Bis）在催化劑的作用下聚合而成的。
 聚丙烯酰胺凝膠電泳可分為連續法和不連續法兩種。從凝膠形式上可分為柱式和板式。裝凝膠柱于直立的玻璃管中進行電泳分離，成為柱式電泳，此法制備凝膠方便，樣品需要量少，凝膠條便于長期保存，板式電泳的優點是能在同一凝膠板上、同一操作條件下，同時比較多個樣品，還可作雙向電泳，便于利用各種測定方法，尤其便于進行放射自顯影操作。
 聚丙烯酰胺凝膠電泳過程中，除去一般電泳的電荷效應以外，還有兩種物理效應：1. 凝膠對樣品的篩選效應：顆粒小、呈球形的樣品分子移動快，顆粒大的、形狀不規則的分子通過凝膠空洞時的阻力大，移動慢。2. 不連續系統對樣品的濃縮效應：由于柱式不連續體系的四個不連續性，導致樣品的在電泳開始時就得到濃縮，然后分離。不連續電泳系統所具備的電荷效應、分子篩選效應和濃縮效應大大提高了它的分辨率。
 
 乳酸脫氫酶(1actatedehytrogenase．LDH)及其同工酶(isoenzyme)是糖代謝中的一種很重要的酶，它催化丙酮酸與乳酸的相互轉化。
  
  LDH是發現最早又研究最多的具有同工酶的一組酶，由于同工酶的分子結構不同，電泳遷移率不同，因此電泳法可將其分開。在哺乳動物中，LDH是由兩種亞基(H亞基和M亞基)通過不同的組合形成四聚體，共有五種同工酶，LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5。這些同工酶在不同器官中的分布及含量不同，各器官都有自己特定的同工酶譜。如心肌中LDHl活性最高，肝臟中LDH5活性最高。正常情況下，血清中LDH同工酶活性較低，多半來自紅細胞的滲出和釋放，經電泳分離，可呈現特定的同工酶譜。
 LDH同工酶經提純后可分為5條區帶，從陽極到陰極的順序依次為LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5。他們均具有LDH催化活性，是一種LDH同工酶。它是由H亞基和M亞基按不同比例組成的四聚體，廣泛的分布于動物的各種組織以及微生物和植物中。這種同工酶通過不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳法可被分離。若通過連續聚丙烯酰胺凝膠電泳則只會出現帶狀條紋，不會分離。
 
 本試驗采用聚丙烯酰胺凝膠電泳連續法，觀察肝、心、腦、肌、血清5種組織中同工酶的含量，若采用不連續法則可以是這些物質中的同工酶得到分離。

試劑及器材

材料
動物未溶血新鮮血清，動物組織提取液（組織重量與組織云將緩沖液體積比為1：5或1：10）

1.2 試劑
1.2.1 PAGE有關試劑
     凝膠貯液、電極緩沖液、AP溶液
1.2.2 LDH同工酶染色貯存液
 5mg/mL氧化性輔酶1溶液
 1mol/L乳酸鈉溶液
 0.1mol/L氯化鈉溶液
 1mg/mLPMS溶液
 1mg/mL氯化硝基四氮唑藍（NBT）溶液
 0.5mol/L pH=7.5磷酸鹽緩沖液
1.2.3 制備組織勻漿緩沖液：0.01mol/L pH=6.5磷酸鹽緩沖液

1.3 器材
 穩壓、穩流電泳儀，垂直板電泳槽（微型），移液管，移液槍，燒杯，培養皿，恒溫水浴，凝膠成象儀。

1.4 步驟

1.4.1. 凝膠配置

試劑名稱 配制20ml不同濃度分離膠所需各種試劑用量/ml 配制10ml濃縮膠所需試劑用量
 5% 7.5% 10% 15% 3%
分離膠貯液 3.33 5.00 6.66   
分離膠緩沖液 2.50 2.50 2.50 2.50 
1%TEMED 2.00 2.00 2.00 2.00 1.00
混勻后，置真空干燥器中，抽氣10min
10% 0.10 0.10 0.10 0.10 0.05

1.4.2. 灌膠
 迅速在兩玻璃板的間隙中灌注丙烯酰胺溶液。注滿后，立即在分離膠溶液中插入干凈的梳子，小心避免混入氣泡，再加入濃縮膠溶液以充滿梳子間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下。濃縮膠聚合完成后，小心溢出梳子。把凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸電極緩沖液。如凝膠底部兩玻璃板之間有氣泡，必須設法排出。

1.4.3. 預電泳
 為防止LDH及其同工酶受凝膠聚合后殘留物的影響，引起酶的鈍化或其他人為效應，再加樣前，應進行預電泳，電泳條件20mA，0.5h，關閉電源后準備加樣。

1.4.4. 加樣
 取10—20μl血清或組織勻漿，加體積40%蔗糖混勻后，用移液槍吸取20—30μl樣品，小心加在凹形樣品槽內。

1.4.5. 電泳
 加樣后打開電源，將電流調至10mA，待樣品進入分離膠后，改為20—25mA，當溴酚藍前沿距離橡膠眶下緣1-20cm時，將電流調為0，關閉電源。

1.4.6. 染色脫色與制干板
貯存液 NAD 乳酸鈉 NaCl NBT PMS 磷酸緩沖液
用量/ml 4.0 2.5 2.5 10.0 1.0 5.0
 電泳結束后，取下凝膠膜，刮下硅橡膠框，撬開玻璃板，在凝膠右下角切出一小角作為標記，小心取出凝膠板，將其放在盛有染色液的培養皿中，置37度水浴中保溫15-30min，待LDH同工酶呈現藍紫色區帶，即可用蒸餾水洗去染色劑，加入脫色液終止酶反應并使底色脫凈，用凝膠成像儀拍照。
 
試驗結果

結果討論
 根據以上試驗結果，可以看出在肝、心肌、腦、骨骼肌、血清5種組織中同工酶中，同工酶LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5的含量有所不同，心肌中一LDH1含量最高，骨骼肌及肝中的LDH5最高。

本試驗的影響因素以及做好試驗的關鍵是：
制膠時應注意不能產生起氣泡。插入梳子時應傾斜插入，以免產生氣泡
電泳時電流不要太高，應防止熱效應引起LDH失活，電泳應在冰浴中進行。
LDH同工酶活性染色時間不要太長，一般以15—30min為宜，當大多數條帶均呈藍紫色時即可中止染色。
電泳后應迅速撥膠，防止色帶擴散。
所用器材必須清潔。特別是制備凝膠柱所用的玻璃管每次用后必須用洗液浸泡，再常規清洗，否則凝膠剝離困難。
電泳完畢后，上下槽電極緩沖液不可混合，因離子強度和pH值都已發生改變。
丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是神經性毒劑，對皮膚有刺激作用，應避免直接接觸。
 
 
同工酶的染色原理：
 將聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的同工酶凝膠條，加上酶的底物乳酸，則可催化底物脫氫生成丙酮酸。同時生成還原型NADH+H+，它可使吩嗪硫酸甲酯(PMS)還原，后者又使淺黃色的氯化硝基四氮唑藍(NBT)還原成藍紫色，從而顯示各同工酶區帶。其反應式如下：
 
 反應產生的藍紫色即還原型NBT含量與酶活力成正比，可直接觀察顏色的深淺進行分析，也可將染色的膠條用光密度掃描儀進行掃描，根據波峰計算出各同工酶的百分含量。
 

LDH同工酶的應用現狀：
 LDH同工酶的分離及測定在臨床上有重要意義。正常情況下，血清中LDH同工酶活性較低，電泳呈現其特定的同工酶譜。當某組織受損時，該組織中的LDH可釋放到血液中，使血清 LDH的總活性升高，但酶的總活性升高幅度不一定與有關臟器(如心或肝等)的病損程度相一致，故測定酶的總活性對患病器官的鑒別意義不大。但LDH同工酶在不同器官組織中的分布及含量不同，有關的器官組織發生損傷時，可反映在同工酶譜的變化上，故測定LDH同工酶可有助于受損部位的鑒別診斷。如肝臟疾患時，血清中LDH；升高；而在心肌受損時，血清中 LDH，升高，因此電泳分離同工酶，經光密度掃描儀掃描，測出各同工酶的百分含量，不但提高了診斷的靈敏度，而且對病變器官的鑒別也有重要意義。
 此項測定目前常用于診斷心肌梗塞，肝病和某些惡性腫瘤。在診斷心肌梗塞時雖然活性增高的時間比 CK要遲，陽性率也較低，但持續時間較CK長。
1．心肌疾病：心肌梗塞時LDH增高，心肌梗塞發病后8-10小時開始上升，2-3天達高峰，持續1－2周恢復正常。若LDH增高后恢復遲緩，或在病程中再次升高者，提示梗塞范圍擴大，預后不良。
2．肝臟疾�。杭毙愿窝谆蚵�性肝炎活動期LDH常顯著或中度增高，其靈敏度低于ALT，肝癌時LDH活性明顯增高，尤其轉移性肝癌時LDH活性增高更明顯。
3．血液病：白血病、貧血、惡性淋巴瘤等LDH活性增高。
4．其它：肌營養不良、橫紋肌損傷、胰腺炎、肺梗塞等LDH活性也增高。
由于LDH存在于很多組織中，其總活性測定不能特異地反映某一組織或器官的情況，為了進一步了解某一器官的病變，可測定LDH同工酶有助于區別不同組織來源。
 人血清中含有五種LDH同工酶，它們是由H(心肌型)和M[骨焰肌型)兩類亞基組成的不均一的五種四聚體。按其在瓊脂電泳中泳動的快慢，由正極向負極依次為LDHl、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5。心臟、腦、紅細胞等富含LDHl和LDH2，而肝臟及骨鉻肌則含LDH4和LDH5最多。因此測定LDH同工醇有助于病變器官的定位。

參考文獻：
① 劉箭   生物化學實驗教程   科學出版社
② 韋和平   生物化學實驗與指導   中國醫藥科學出版社