成年線蟲線粒體未折疊蛋白質反應失活的基因篩選

成年線蟲線粒體未折疊蛋白質反應失活的基因篩選

摘    要

線粒體未折疊蛋白質反應是近年來才被關注的線粒體修復反應，對于線粒體功能的維持具有重要作用，但是其具體特性和機制并不清楚，其中有一個非常有意思的現象是成年線蟲線粒體未折疊蛋白質反應會失活。本文發現線粒體未折疊蛋白質反應不能被內質網抑制劑激活，內質網未折疊蛋白質反應也不能被線粒體抑制劑激活。本文確定了RNAi（atp-2，spg-7）及抗霉素A不能誘導線粒體未折疊蛋白質反應的時期分別在線蟲L4時期和成蟲第六天。并利用RNAi基因篩選的方法對spg-7 RNAi誘導線蟲線粒體未折疊蛋白質反應失活進行了研究。對轉錄因子，激酶和神經肽三個文庫約1036個基因篩選，找到了zip-1和mbk-2兩個基因。除此之外，還發現了一些出乎意料的現象：1）不同濃度的抗霉素A對于線粒體未折疊蛋白質反應誘導的影響并不大；2）高滲環境并沒有誘導線粒體未折疊蛋白質反應的發生；3）在線粒體未折疊蛋白質反應發生時，線蟲并沒有表現出躲避食物的行為。本文的結果為線粒體未折疊蛋白質反應消失的研究奠定了基礎，對于線粒體未折疊蛋白質反應的研究具有重要意義。

關鍵詞：線粒體未折疊蛋白質反應，線蟲，RNAi基因篩選 

Abstract

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目      錄

1緒論1

1.1課題背景及目的1

1.2 國內外研究現狀3

1.2.1 未折疊蛋白質反應3

1.2.2 線粒體未折疊蛋白質反應及其機理5

1.2.3 成年線蟲線粒體未折疊蛋白質反應失活7

1.2.4 線粒體未折疊蛋白質反應與線粒體自噬的關系8

1.3 課題研究方法9

1.4論文構成及研究內容10

2 研究方案11

2.1 研究目標11

2.2 儀器設備、材料、試劑藥品的選擇11

2.3 實驗內容12

2.3.1 線蟲化凍、培養及凍存12

2.3.2 線蟲周期同步化13

2.3.3 線蟲線粒體未折疊蛋白質反應消失的時期確定13

2.3.4 線蟲線粒體未折疊蛋白質反應消失的基因篩選14

2.3.5 atfs-1點突變質粒的構建15

2.3.6 其他實驗方法15

3 實驗結果17

3.1 RNAi活性檢測17

3.2 線蟲線粒體未折疊蛋白質反應消失時期測定18

3.3 線粒體未折疊蛋白質反應消失的基因篩選25

3.4 線粒體未折疊蛋白質反應的特性27

3.4.1 不同濃度抗霉素A對線粒體未折疊蛋白質反應的影響27

3.4.2 線粒體未折疊蛋白質反應的特異性檢測28

3.4.3 目前已知線粒體未折疊蛋白質反應有關的基因抑制30

3.4.4 發生線粒體未折疊蛋白質反應時線蟲的避食行為31

3.5 atfs-1點突變質粒構建及檢測32

4 討論與展望35

4.1 成年線蟲線粒體未折疊蛋白質反應失效35

4.2 線蟲線粒體未折疊蛋白質反應的基因篩選36

4.3線蟲線粒體未折疊蛋白質反應的特性38

4.4 atfs-1點突變質粒及應用39

4.4 展望40

結論42

致謝43

參考文獻44

附錄A 49

附錄B 51

附錄C 53

附錄D 55

附錄E 56

附錄F57

附錄G58

附錄H59