脯氨酸羥化酶3在心肌細(xì)胞調(diào)亡中的作用及機(jī)理

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方法：我們選取阿霉素處理的H9c2大鼠胚胎心肌細(xì)胞株作為心肌細(xì)胞凋亡模型，通過(guò)細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)（MTT）、線粒體膜電位（ΔΨm）和caspase-3活性這幾個(gè)指標(biāo)來(lái)驗(yàn)證凋亡的發(fā)生和程度。通過(guò)PHD3 overexpress和 knockdown穩(wěn)轉(zhuǎn)H9c2細(xì)胞株來(lái)驗(yàn)證PHD3在凋亡過(guò)程中的調(diào)控作用。通過(guò)應(yīng)用PHD羥化活性抑制劑和PHD3失去酶活性的突變來(lái)驗(yàn)證其在調(diào)亡過(guò)程的調(diào)控作用是否依賴其羥化酶活性。用免疫印跡、細(xì)胞轉(zhuǎn)染后免疫共沉淀和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的方法來(lái)研究PHD3調(diào)節(jié)凋亡過(guò)程的機(jī)制。
結(jié)果：阿霉素處理的H9c2細(xì)胞24小時(shí)后細(xì)胞活力和線粒體膜電位下降，caspase-3活性增加，與此同時(shí)PHD3表達(dá)增加。與H9c2細(xì)胞相比，PHD3 overexpress的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株在阿霉素處理后，細(xì)胞活力和線粒體膜電位更低，caspase-3活性更高；而PHD3 knockdown穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株則與PHD3 overexpress穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株結(jié)果相反。PHD3抑制劑或失去酶活性突變的應(yīng)用結(jié)果與PHD3 knockdown類(lèi)似。免疫共沉淀結(jié)果顯示PHD3能與Bcl-2家族中的Bcl-2共沉淀，而不與Bcl-xL、Mcl-1或Bax共沉淀。熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PHD3-CFP與Bcl-2-YFP之間的FRET效率與陽(yáng)性對(duì)照無(wú)差別。Bcl-2缺失BH4結(jié)構(gòu)域得突變（Bcl-2△BH4）不能PHD3共沉淀，而單獨(dú)的Bcl-2的BH4結(jié)構(gòu)域（Bcl-2-BH4）仍可與PHD3共沉淀。與H9c2細(xì)胞相比，在PHD3 overexpress穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的Bcl-2沉淀物中Bax的量較少。
結(jié)論：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PHD3可促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡，這種促進(jìn)作用是羥化酶活性依賴的，并且是通過(guò)與Bcl-2的BH4結(jié)構(gòu)域的相互作用，進(jìn)而降低了Bax- Bcl-2復(fù)合物的形成實(shí)現(xiàn)的。這一發(fā)現(xiàn)提示我們可以通過(guò)干預(yù)PHD3來(lái)提高心臟疾病中的心肌細(xì)胞的存活能力或者降低阿霉素作為抗腫瘤藥物的心臟毒性作用。

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